论文摘要
一、背景胆管癌是起源于胆道上皮细胞的恶性肿瘤,在肝胆系统恶性肿瘤中约占15%,仅次于肝细胞癌,其发病率在全球范围内呈上升趋势。胆管癌的发病率和死亡率逐年升高与目前缺乏早期诊断方法及其发病机制尚不清楚有关。尽管目前临床对胆管癌的治疗手段种类繁多,但对早期胆管癌进行外科手术切除仍被认为是治愈胆管癌的唯一有效方法。神经生长因子（ nerve growth factor, NGF）是神经营养因子（ neurotrophin, NT）家族的重要成员,其生物学作用在近年来得到极为广泛的研究。NGF除了在神经系统维持神经元的生长、分化外,通过与其受体结合在多种肿瘤的增殖、凋亡、分化以及侵袭转移中发挥不同的生物学效应。目前一些关于肿瘤靶点治疗的研究也围绕NGF及其受体展开。NGF及其受体在肿瘤细胞中的表达及其与肿瘤的关系受到越来越多的关注。与胰腺癌等消化系统肿瘤相同,胆管癌在发生发展的过程中除延淋巴管转移、血行转移外,还存在另一种相对独立的转移方式即“神经浸润”。临床研究表明60%-88%的胆管癌发生神经浸润,通过神经浸润加速肿瘤原发病灶的直接扩散是胆管癌的重要生物学行为和不良预后因素。发生神经浸润的胆管癌患者,术后复发率显著升高且5年生存率明显下降。通过对NGF及其受体在肿瘤中表达情况的检测发现,NGF及其高亲和力酪氨酸激酶受体A（tyrosine kinase receptors A, TrkA）高表达于胆管癌和胰腺癌组织并且与肿瘤细胞的神经浸润显著相关。研究者推测,胰腺癌、胆管癌细胞分泌的NGF可能与表达于神经束膜表面的NGF高亲和力受体TrkA结合,为神经细胞轴突向肿瘤方向生长以及肿瘤细胞延神经浸润转移提供了适宜的微环境和化学趋化作用,这可能是NGF促进肿瘤细胞神经浸润的重要机制。在对肿瘤细胞嗜神经性的研究中还发现,外源性NGF可通过与嗜铬细胞瘤PC12细胞表面TrkA结合使肿瘤细胞整合素类层粘连蛋白受体表达增加,神经营养因子家族中一些其他成员对胰腺癌细胞也有类似的作用。我们在以往的研究中发现分子量为67KDa的层粘连蛋白受体（67LR）与胆管癌侵袭转移密切相关,调控67LR可以影响胆管癌细胞基质金属蛋白酶（MMP-2）及尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶（u-PA）等多种水解酶类的表达,从而加速胆管癌细胞对基底膜的水解破坏,影响胆管癌细胞的侵袭能力,但目前有关NGF在促进胆管癌细胞神经浸润过程中与67LR的关系尚无文献涉及。二、目的本课题拟通过研究外源性NGF对人胆管癌细胞67LR表达水平及其体外侵袭能力的影响,为进一步探索胆管癌侵袭转移尤其是神经浸润的机制提供实验依据,同时为胆管癌的诊断和预后判断提供新的理论依据,并为寻找肿瘤治疗新的突破口提供研究基础。三、方法在通过细胞免疫荧光及激光共聚焦、流式细胞技术证实QBC939人胆管癌细胞表面存在NGF高亲和力受体TrkA表达后,用不同浓度的外源性β-NGF对胆管癌细胞进行处理,采用Real-Time PCR和Western-blot分别检测QBC939细胞67LR mRNA及蛋白的表达情况,同时检测不同浓度的TrkA阻断剂K252a对β-NGF生物学作用的阻断效果。用Transwell的方法进行肿瘤细胞体外侵袭实验,评价外源性NGF对胆管癌细胞体外侵袭能力的影响。四、结果QBC939细胞表面NGF高亲和力受体TrkA表达明显,TrkA表达阳性的细胞比例为64.77±8.08%（n=3）。经外源性β-NGF处理后QBC939细胞67LR mRNA和蛋白水平表达均显著增强,对照组和不同浓度β-NGF组比较差异有统计学意义（F=22.4,P<0.01; F=14.6, P<0.01）,其中100ng/ml组显著高于其他各组（P<0.05）。β-NGF的生物学作用可被TrkA阻断β-NGF剂K252a阻断,对照组与不同浓度K252a组间67LR mRNA和蛋白水平表达差异有统计学意义（F=14.1,P<0.01; F=8.9, P<0.01）,其中300nM K252a可完全阻断100ng/mlβ-NGF对QBC939细胞67LNR表达的影响,该组67LR mRNA和蛋白表达水平与对照组无统计学差异（P>0.05）。在用Transwell小室检测胆管癌细胞体外侵袭能力的实验中发现,QBC939细胞细胞经100ng/mlβ-NGF处理后体外侵袭能力显著增强,穿膜细胞数明显高于对照组（P<0.05）,同时300nM K252a可完全阻断100ng/mlβ-NGF对QBC939细胞侵体外袭能力的影响（P﹥0.05）。五、结论1.通过细胞免疫荧光及激光共聚焦、流式细胞技术检测发现,NGF高亲和力受体TrkA在QBC939人胆管癌细胞中存在较高的表达水平,因此QBC939细胞做为本课题研究的实验对象,为研究的深入展开提供了良好的细胞学基础。2.外源性NGF通过与胆管癌细胞表面高亲和力受体TrkA结合,使胆管癌细胞67LR表达显著增加。3.外源性NGF通过与其高亲和力受体TrkA结合使胆管癌细胞体外侵袭能力明显增强,这一生物学作用可能与NGF上调胆管癌细胞67LR表达密切相关。