论文摘要
细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus, Eg）是囊性包虫病的病原体,棘球蚴以包囊形式在人和有蹄兽类等中间宿主的内脏器官中生长。细粒棘球绦虫的生活史中包含了四个不同的时期:卵或六钩蚴,包囊虫,原头蚴和成虫。在棘球蚴的早期发育阶段,包囊自身和宿主的新陈代谢及对感染产生的免疫应答都会产生大量的不稳定的活性氧类物质（reactive oxygen species, ROS）,ROS具有很高的反应性,能够对蛋白、膜脂和DNA造成直接的损伤,产生严重的生物学效应,当在机体内大量堆积时可导致细胞和组织的死亡。为了适应高度的氧化胁迫压力的环境及逃避宿主的免疫应答反应,寄生虫通过合成抗氧化酶并大多在宿主—寄生虫的接触面表达以适应及抵抗氧化胁迫的压力。抗氧化酶在保护寄生虫抵御来自宿主新陈代谢和白细胞激活的ROS的氧化损伤起关键作用。硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidases, TPx）基因家族是一个很大的抗氧化蛋白家族,从原核到真核,广泛存在于生物体中,具有强大的抗氧化功能。TPx在寄生虫逃避氧化性伤害过程中起着重要的作用。若能将此功能阻断,则可以减弱或使包虫的生理机能丧失,从而导致其死亡,这将为疫苗的研制和特效药的筛选奠定基础。原头蚴在天然情况下可以向两个方向发育分化:一个是无性繁殖方向分化形成包囊,另一个是有性繁殖方向分化形成能产卵的成虫。本研究首先利用双相培养方法,掌握了原头蚴体外培养及无性发育至包囊阶段的技术,为建立药物筛选的体外模型,研究虫体发育及生活各阶段的基因功能打下基础。应用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达。以H2O2胁迫后的细粒棘球蚴cDNA为试验方（tester）,正常生长的细粒棘球蚴cDNA为驱动方（driver）,构建了H2O2胁迫下与正常细粒棘球蚴差异表达的消减cDNA文库。文库扩增后得到124个阳性克隆,菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段。将整个文库克隆进行测序,测得序列结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。利用定量PCR的方法初步获得了原头蚴在H2O2胁迫24h条件下部分差异表达基因片段在mRNA水平上的表达情况,为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定基础。采用RT-PCR的方法,根据GenBank已发表的细粒棘球蚴硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因的序列设计引物,获取EgTPx的cDNA片段并克隆到原核表达载体pET41-b中,构建原核表达质粒pET41-b-EgTPx,经过IPTG诱导,在原核表达系统大肠杆菌E.coli （BL21）中获得可溶性表达的融合蛋白,经过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化融合蛋白,免疫小鼠获得高效价的特异性抗血清。ELISA和Western blot结果表明融合蛋白免疫小鼠产生了高效价和特异性强的抗血清。为深入开展EgTPx基因功能研究和免疫学诊断试剂,及疫苗的开发分析奠定了物质基础。利用重组EgTPx多克隆抗体,经消化处理后的原头蚴制备石蜡切片,以间接免疫荧光法确定抗氧化蛋白EgTPx在原头蚴内的分布。结果表明,EgTPx多克隆抗体能够特异性地结合天然EgTPx抗原表位, EgTPx广泛分布在原头蚴的体表皮层、皮下层和钙颗粒细胞内。构建了原头蚴EgTPx基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的虫体表达载体,命名为pPD-EgTPx,通过脂质体转染活性状态良好的原头蚴,在倒置荧光显微镜下观察该基因在原头蚴中的瞬时表达。结果表明,虫体表达载体pPD-EgTPx构建正确,而且能够在原头蚴中进行瞬时表达。总之,本研究为细粒棘球蚴在抗氧化过程中相关靶基因的筛选和功能研究提供了重要的参考,为进一步利用抗氧化基因开展包虫病的预防治疗和疫苗研制提供了物质基础,具有重要的现实意义。
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