siRNA干扰HPV16E6基因对人鼻咽癌HNE-1细胞株的影响

论文摘要

背景:鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤,早期NPC患者对放射治疗敏感,但晚期NPC患者放射治疗疗效欠佳,易出现复发和转移。因此,寻找新的治疗肿瘤的方法迫在眉睫。新的RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,在肿瘤的治疗中显示了极具前景的应用价值。它通过一些小的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）阻断特定基因的表达,诱导mRNA的降解,达到“基因沉默”（gene silencing）、抑制细胞增殖和侵袭的功效,从而抑制肿瘤的生长和转移。有研究证实,人类乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）与头颈部恶性肿瘤有密切关系,主要为高危的HPV16、18型,其中HPV16的E6蛋白表达水平是维持癌症恶性表型的必要条件。已有研究显示,利用RNAi技术干扰HPV16E6基因能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡,但有关RNAi技术干扰HPV16E6基因对鼻咽癌细胞株的影响报道甚少。本研究旨在探讨利用RNAi技术干扰HPV16E6基因对鼻咽癌HNE-1细胞株的影响。目的:本研究以人鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象,用针对HPV16E6的小片段干扰RNA（small interfering RNAs,siRNA）转染细胞,干扰鼻咽癌细胞株中HPV16E6基因转录及蛋白表达,并探讨siRNA对HNE-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响作用。方法1.转染细胞:查找HPV16E6基因序列,设计针对E6基因的4对siRNA。将siRNA转染入HNE-1细胞,并在荧光显微镜下检测转染效率。2.筛选有效的siRNA。实验分为5组:4对siRNA组及阴性对照组。采用RT-PCR技术检测转染后HPV16E6 mRNA的表达,Western blot及免疫细胞化学法检测转染后HPV16E6蛋白表达情况,筛选出对HPV16E6干扰有效的siRNA。以有效的siRNA进行下一步实验,同时设立细胞空白组（未转染组）及阴性对照组（siRNA-5转染组）。3.采用MTT法观察各实验组细胞的增殖情况。4.采用流式细胞仪检测各实验组的细胞周期。5.流式细胞仪检测各实验组细胞的凋亡。6.侵袭实验检测各实验组细胞的侵袭力变化。结果1.将转染后24h的细胞在荧光显微镜下观察,可见绿色荧光,说明转染成功,计算转染率为60%。2.转染后48h,RT-PCR检测结果显示,siRNA-3转染组对HPV16E6 mRNA的抑制率为66.3%,与其余4组相比,差异有显著意义（P<0.05）;Western blot检测发现siRNA-3明显抑制HPV16E6蛋白表达,抑制率为56.7%,有统计学意义（P<0.05）;免疫细胞化学结果显示,阴性对照组中HPV16E6阳性表达细胞数为65.2%,而siRNA-3转染组中HPV16E6阳性表达细胞数为20.1%,提示HPV16E6蛋白表达被抑制。3.MTT结果显示,在转染24h、48h、72h后,细胞增殖抑制率分别为24%、23%、30%,较阴性对照组明显降低,差异有显著意义（P<0.05）。4.流式细胞仪检测细胞周期,结果显示转染了siRNA-3后G0-G1期比率为80.46%,而阴性对照组其比率为65.55%,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞仪检测发现,转染siRNA-3后HNE-1细胞凋亡率约为16.82%,与阴性对照组相比,有统计学意义（P<0.05）。6.侵袭实验发现,实验组穿膜细胞数（45.3±4.0）明显少于细胞空白组穿膜细胞数（146.7±5.5）及阴性对照组穿膜细胞数（147.7±4.7）,差异有显著的统计学意义（P<0.05）。结论1.针对HPV16E6的siRNA可以有效地抑制鼻咽癌HNE-1细胞株中HPV16E6 mRNA及蛋白的表达。2.siRNA干扰HPV16E6基因能显著地降低人鼻咽癌HNE-1细胞株的增殖能力。3.siRNA干扰HPV16E6基因能使人鼻咽癌HNE-1细胞株的DNA合成下降（S期细胞分布比例降低）,细胞生长停滞于G0-G1期。4.siRNA干扰HPV16E6基因能诱导人鼻咽癌HNE-1细胞株的凋亡。5.siRNA干扰HPV16E6基因能降低人鼻咽癌HNE-1细胞株的侵袭能力。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 HPV16E6 siRNA 对鼻咽癌HNE-1 细胞中E6 基因及蛋白表达的抑制
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第二部分 RNAi 抑制E6 基因的表达对HNE-1 细胞生物学特性的影响
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 一.全文小结
• 二.本文的创新之处
• 三.本文的不足之处
• 参考文献
• 附图
• 文献综述：RNAi 技术与肿瘤的基因治疗
• 致谢
• 硕士期间发表的文章