陆地棉农杆菌介导遗传转化体系的优化与利用

论文摘要

传统的棉花农杆菌介导转化使用子叶和下胚轴为外植体，以Coker 312作为模式品种。由于其转化和再生经历体细胞胚胎发生，所以该方法被认为是棉花转化的首选方法，并为棉花转基因做出了巨大的贡献。但这一体系受到了基因型的严重限制，即便是转化成功了的品种仍然受转化周期长、成胚率低、易出现畸形胚、体细胞胚植株再生比例低和缺乏茎的伸长等因素的限制。本研究对传统的转化体系进行了优化，以长江流域主栽品种泗棉3号为受体建立了下胚轴为外植体的高效的转化体系，并首次将插皮接用于棉花再生植株的嫁接；为了进一步提高转化的效率，建立和优化了以泗棉3号胚性愈伤为受体的转化体系，利用此体系已将多个基因成功导入泗棉3号；利用组织培养的方法对WO品系和泗棉3号的再生潜力进行研究。研究的结果如下：1．分析了影响传统转化体系转化效率的因素；通过改变诱导愈伤时的氮素形态、及时挑选胚性愈伤、利用代谢胁迫促进再生出苗等措施对转化体系进行了优化。对各种胁迫的直接和间接效应以及不同氮素形态的供应进行了理论分析，结果显示氮素形态和透气胁迫对体系的优化至关重要。首次将插皮接技术用于棉花再生植株的繁殖，该技术要求简单，操作方便，成活率90％，延长了砧木的使用时间，有效的缩短了再生植株缓苗时间。2．以长江流域棉区主栽陆地棉品种泗棉3号下胚轴为外植体建立了高效的转化体系，得到了大量的转基因植株，并提供了相关的分子证据和基因表达证据。发现泗棉3号出现分化中心的主要形态不同于Coker 312，其胚性愈伤组织主要来源于两类初生愈伤组织。收获到部分T0植株的种子，对它们的T1代植株进行了PCR检测和卡那霉素抗性鉴定；在T0和R0代获得了丰富的花器官和株型变异体。3．通过优化胚性愈伤的繁殖、胚性愈伤的共转化、选择培养和分化成苗技术提高了农杆菌转化棉花胚性愈伤体系的转化效率。感染时受体愈伤状态、共培养的效率和选择培养基的选择效率对转化的效率至关重要。鲜黄的细颗粒状胚性愈伤共转化效率高；AS（乙酰丁香酮）50mg．L-1和共培养温度19℃转化效率最高，AS和培养温度存在显著的互作。胚性愈伤接种尽量分散降低了假阳性，提高了选择效率。该转化方法的周期为5～6个月，阳性率为55.7％，平均每个克隆可获得9.7株转基因植株。采用胚性愈伤的转化方法降低了工作量和成本，提高了转化效率，使规模转化棉花成为现实，为棉花的遗传改良和棉花重要基因的功能分析奠定了基础。4．以组织培养为手段，对棉花再生能力进行选择同时对胚胎发生的时间和频率、出现分化中心时愈伤的状态和愈伤生长量、以及再生植株有无变异和育性进行选择，获得了品系WO的再生纯系；对泗棉3号进行了第一轮的选择，再生频率由4.5％提高到40％左右，并获得了一个由组培引起的可以遗传的突变体。5．采用优化了的以下胚轴为外植体的转化方法，经分子验证和基因表达检测（PCR、Southern、RT和点涂PPT），成功的将bar基因导入了模式品种Coker 312，获得了高抗PPT的转化植株．现已获得T1代抗性植株和1个可以遗传的表型突变体，有待于进一步纯合和分析。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 常用的植物转基因方法
• 1 农杆菌介导转化法
• 1.1 T-DNA的转化机制以及VIR区基因群的作用
• 1.2 转化的过程及载体策略
• 1.3 转化方法的延伸和受体的扩展
• 2 基因枪介导转化法
• 3 花粉管通道法
• 第二章 植物组织培养和植株再生的影响因素
• 1 外植体的选择
• 2 基因型的选择
• 3 组织培养的种类
• 4 培养条件
• 4.1 培养基的组成成分
• 4.2 光、暗处理
• 4.3 温、湿度
• 4.4 细胞培养容器
• 5.器官发生、胚胎发生和植株的再生
• 第三章 棉花植株再生和农杆菌介导的转化体系研究进展
• 1.标准的再生和转化体系的优化
• 1.1 影响棉花转化效率的因素
• 1.2 通过营养和微环境调节进行代谢胁迫,缩短培养时间提高再生效率
• 1.2.1 胚性愈伤的诱导
• 1.2.2 胚状体的形成
• 1.2.3 体细胞胚的成熟
• 1.2.4 胚的萌发
• 1.3 利用胚性愈伤为受体缩短转化周期,提高转化效率
• 2.选择不同的组织或器官作为受体来打破基因型的限制
• 2.1 子叶节为外植体诱导丛生芽和以茎尖为受体的转化体系
• 2.2 农杆菌介导的转化花粉授粉后进而获得转化植株
• 3.选择高频再生潜力的基因型和基因型的拓展
• 第二部分 研究报告
• 第四章 陆地棉传统的农杆菌介导遗传转化体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 培养基
• 1.3.1 农杆菌培养基
• 1.3.2 棉花组培培养基
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体的转化
• 2.1.1 影响侵染效率的因素
• 菌种的培养和处理
• 外植体处理
• 2.1.2 初生愈伤的诱导和增殖及其对胚胎发生的作用
• 2.2 胚性愈伤的诱导、获得和gus速测
• 2.3 由胚性愈伤到再生植株的影响因素和优化
• 2.4 几种氮素状态在再生体系中的作用
• 2.5 插皮接在再生植株嫁接中的应用
• 2.5.1 插皮接应用效果分析
• 2.5.2 管理要点
• 2.5.3 较大砧木的嫁接
• 2.6 体系的优化
• 3 结论
• 4.讨论
• 第五章 泗棉3号下胚轴为外植体转化体系的建立和利用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化的方法
• 1.2.2 gus基因的组织化学检测
• 1.2.3 PCR检测
• 1.2.4 SOUTHERN BLOTTING检测
• 1.2.5 卡那霉素抗性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 泗棉3号转化体系的建立
• 2.1.1 感染后出愈率和分化率的比较
• 2.1.2 泗棉3号胚性愈伤组织诱导的特殊性
• 2.1.3 PCR检测
• 2.1.4 SOUTHERN检测
• 2.2 泗棉3号转化体系的利用
• 3 结论
• 4 讨论
• 第六章 农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 农杆菌和质粒
• 1.2 胚性愈伤的制备和保存
• 1.3 转化和植株再生
• 1.4 gus基因组织化学检测
• 1.5 PCR检测
• 1.6 SOUTHERN BLOTTING检测
• 2 结果
• 2.1 胚性愈伤的繁殖和受体愈伤的选择
• 2.2 gus组织化学检测分析AS、温度和时间对瞬间转化的影响
• 2.3 抗性愈伤的获得和植株再生
• 2.4 再生植株的gus组织化学检测
• 2.5 PCR检测
• 2.6 npt II基因的SOUTHERN检测
• 3 结论与讨论
• 第七章 高频再生品系的选择
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试品种
• 1.1.2 培养基
• 1.2 组织培养的方法
• 1.3 选择的方法
• 2.结果与分析
• 2.1 从WO品系中筛选到高频再生的纯系
• 2.1.1 选择
• 2.1.2 获得的纯系作为受体在转化时的表现
• 2.2 从泗棉3号中筛选高频再生的品系
• 3 讨论
• 第八章 bar基因转化COKER 312的研究
• 1.材料和方法
• 1.1 棉花品种
• 1.2 载体和质粒
• 1.3 遗传转化方法
• 1.4 培养基
• 1.4.1 农杆菌培养基
• 1.4.2 棉花组培培养基
• 2 结果与讨论
• 2.1 转基因植株的分子验证
• 2.1.1 PCR验证
• 2.1.2 SOUTHERN BLOTTING
• 2.2 基因表达的检测
• 0代植株的RT-PCR'>2.2.1 T₀代植株的RT-PCR
• 0代植株抗PPT鉴定'>2.2.2 T₀代植株抗PPT鉴定
• 1代转bar基因植株的遗传分析和性状考察'>2.3 T₁代转bar基因植株的遗传分析和性状考察
• 3 结论与讨论
• 全文的结论
• 参考文献
• 博士期间发表论文
• 致谢