油菜ATPS基因克隆、原核表达及其活性鉴定

论文摘要

油菜（Brassica napus）是世界范围内重要的经济作物,是需硫量较高的作物之一。ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase,ATPS,EC 2.7.7.4）广泛存在于动物、植物、微生物中,但它在各种生物体当中的生物学作用略有不同。ATP硫酸化酶,可催化ATP和SO42-生成APS和PPi,也可以催化此过程的逆反应;随着ATP硫酸化酶研究的深入,ATP硫酸化酶已从各种生物中提取得到,并已应用于商业生产之中。原核表达系统是目前最为成熟的表达系统。pET系统是在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。故本研究采用常用的pET载体及大肠杆菌原核表达系统,试图获得大量目的蛋白。1997年NCBI公布了来自Brassica napus的ATP硫酸化酶全长mRNA基因序列U28618,但是油菜ATP硫酸化酶在原核细胞中高效表达的研究目前尚未见报道。酵母ATP硫酸化酶现已经在原核中得到表达,并可应用于焦测序。为了进一步开发和研究ATP硫酸化酶,本文克隆了油菜‘秦优8号’的ATP硫酸化酶的cDNA序列,构建了高效的原核表达载体,采用包涵体纯化和复性技术得到了原核细胞表达的具有一定活性的油菜ATPS蛋白,为进一步研究油菜ATP硫酸化酶结构和特性奠定了实验基础。获得的主要研究结果如下:1.提取油菜‘秦优8号’叶片总RNA,以NCBI公布的油菜全长mRNA序列为基础,设计引物,应用RT-PCR的方法从油菜‘秦优8号’中克隆出了RATPS8的含有完整ORF的cDNA序列,大小为1388bp,将其连入克隆载体pMD19-T后测序,测序结果比对推测其为叶绿体的ATP硫酸化酶基因片段。2.将RATPS8连入pET-21a（+）表达载体中,得到了重组表达载体pET21a（+）- RATPS8,再转化到原核细胞BL21（DE3）中,经鉴定得到了重组表达菌BL21-pET21a（+） -RATPS8,并成功地实现了RATPS8在大肠杆菌原核表达系统中的高效表达。将ATPS进行SDS-PAGE分析,切下目的蛋白,采用电洗脱法和丙酮沉淀法纯化ATPS蛋白。3.对包涵体形式表达RATPS8的重组菌BL21-pET21a（+）-RATPS8的培养及诱导条件进行了优化,提高了包涵体的产量,并对包涵体复性的条件进行了的探索。初步测定了重组油菜ATP硫酸化酶复性后的活性。结论:本试验克隆出了油菜‘秦优8号’的ATP硫酸化酶的cDNA序列,并成功的构建了重组原核表达载体,实现了油菜ATP硫酸化酶的高效重组表达;纯化了油菜ATPS蛋白,鉴定了油菜ATPS的活性,为测定油菜ATP硫酸化酶的表达部位和表达量提供一定的实验基础,也为油菜ATP硫酸化酶的结构和功能及其应用奠定理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 硫营养的重要性
• 1.2 植物体中硫的吸收、运输和同化
• 1.2.1 植物体中硫的吸收和运输
• 1.2.2 植物体中硫的同化和代谢
• 1.3 硫同化中的关键酶
• 1.3.1 ATP 硫酸化酶
• 1.3.2 PAPS 还原酶（PAPR）
• 1.3.3 腺嘌呤-5’-磷酸硫酸还原酶（APR）
• 1.4 原核表达的特点
• 1.4.1 原核表达的优点
• 1.4.2 包涵体及复性
• 1.5 研究目的意义及技术路线
• 1.5.1 研究目的及意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂、配制方法
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 ATP 硫酸化酶基因的克隆及表达载体的构建
• 2.2.3 原核诱导表达
• 2.2.4 包涵体表达条件优化及复性、纯化
• 2.2.5 ATP 硫酸化酶纯化
• 2.2.6 酶活性鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 ATP 硫酸化酶基因的克隆和序列分析
• 2.3.2 表达载体构建
• 2.4 讨论
• 2.4.1 载体构建及表达体系建立
• 2.4.2 ATP 硫酸化酶表达及纯化
• 2.4.3 ATP 硫酸化酶的活性鉴定
• 第三章 结论与展望
• 3.1 结论
• 3.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介