玉米黄质合成关键基因表达载体的构建与玉米茎尖生长点的农杆菌介导转化

论文摘要

玉米黄质,或称玉米黄素（Zeaxanthin,3,3-二羟基-β-胡萝卜素）,脂溶性化合物,属叶黄素类类胡萝卜素。玉米黄质分子中含有40个碳和11个共轭双键,使其具有鲜明的颜色和强抗氧化性。由于其独特的化学性质,玉米黄质在预防眼睛黄斑退化所致失明与老年性白内障、预防部分肿瘤的发生和发展、减少某些心血管病的危险发生方面具有显著作用。作为三大主要粮食作物之一的玉米,其籽粒中玉米黄质含量丰富,通过基因工程育种,培育富含玉米黄质的鲜食玉米,可以进一步发挥其保健应用价值,具有较大的发展前景。转基因技术经过二十多年的发展,日臻完善,利用转基因技术获得高品质玉米具有高效、快捷且针对性强的特点。目前,玉米规模化转基因主要以愈伤组织为受体,其诱导和培养受玉米基因型和取材季节的限制很大,且培养、转化、筛选和再生的周期较长,转基因操作的规模一般较小,难以保证转化成功。以茎尖生长点为受体的农杆菌介导的原位转化法,不依赖于组织培养,受基因型限制小,操作简单,实验周期短,可以从绝大多数材料中获得转基因植株。但是,转化效率还有待提高,而且所获转化体大多为嵌合体,后代分离鉴定较为困难,所以还需要进一步研究改进。玉米黄质的生物合成包括缩合、脱氢、环化、羟基化及环氧化等一系列反应。在此过程中β-胡萝卜素环羟化酶（β-Carotene Hydroxylase, BCH）与玉玉米黄质环氧酶（Zeaxanthin epoxidase, Zep）分别对玉米黄质的合成积累与氧化分解起着至关重要的作用。因此,本研究探索构建BCH基因过量表达、Zep基因反义mRNA抑制和RNA干扰载体,通过农杆菌介导的茎尖生长点原位转化法转化玉米幼苗,以期调控BCH与Zep在玉米籽粒胚乳中的表达,使BCH基因表达量上升、沉默Zep基因或使其表达量下降,从而最终达到玉米黄质过量积累的目的。首先,分析NCBI上提交的BCH与Zep基因mRNA序列与所用载体的多克隆位点,用primer5.0分别设计引物并在5’端引入适合的酶切位点,扩增BCH基因mRNA全长序列与Zep基因mRNA反义链序列作为连入表达载体的目的片段。选择Zep基因：mRNA保守区域547 bp片段作为RNAi靶序列,用两对连有不同酶切位点的特异引物进行扩增,将扩增得到的两个片段正反两个方向连入pSKintron载体内含子两端的多克隆位点中,得到正反向序列间间隔一段150 bp玉米内含子序列的反向重复结构,以便转录后形成发夹结构。最后,利用引物引入的酶切位点将BCH基因mRNA全长序、Zep基因mRNA反义链与反向重复结构分别连入经改造以Ubiquitin为启动子、T-NOS为终止子、Bar基因为筛选标记的表达载体pTF101.1M上,构建成本研究的三个载体：BCH基因过表达载体BCHOE、Zep基因反义表达载体ZepAE和RNA干扰载体ZepRNAi。通过冻融法将表达载体质粒转入农杆菌菌株EHA105,以玉米自交系“18-599白”茎尖生长点为受体进行原位转化,BCHOE、ZepAE与ZepRNAi三个载体通过农杆菌介导分别获得转化苗812、520和705株。经0.2g/L草丁膦筛选分别得到抗性植株64、42与74株,抗性率分别为7.89%、8.08%与10.50%。上述结果表明,农杆菌介导的玉米茎尖为受体的遗传转化体系操作简便,与依赖于愈伤组织为受体的转化相比,用时大幅缩短,具有可行性,转化获得的抗性植株经进一步鉴定后可用于富含玉米黄质转基因优良品种培育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 玉米黄质
• 1.1.1 玉米黄质的理化性质
• 1.1.2 玉米黄质的合成途径
• 1.1.3 玉米黄质的作用
• 1.1.4 玉米黄质研究现状
• 1.2 基因表达调控手段
• 1.2.1 基因的过表达
• 1.2.2 反义mRNA抑制技术
• 1.2.3 RNA干扰及其在转基因植物研究中的应用
• 1.3 玉米遗传转化的研究进展
• 1.3.1 玉米转化的受体系统
• 1.3.2 玉米转化的方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株、质粒和引物
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 培养基和抗生素
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 玉米总RNA提取（Trizol法）
• 2.2.2 cDNA的合成
• 2.2.3 常用实验方法
• 2.2.4 β-胡萝卜素羟化酶表达载体的构建
• 2.2.5 玉米黄质环氧酶RNAi载体的构建
• 2.2.6 玉米黄质环氧酶反义mRNA表达载体的构建
• 2.2.7 表达载体转化农杆菌
• 2.2.8 玉米茎尖生长点的原位转化
• 2.2.9 抗性植株筛选与分子检测
• 3. 结果与分析
• 3.1. BCHOE载体构建结果
• 3.1.1 模版序列的获得与测序结果
• 3.1.2 BCH表达载体构建结果
• 3.2 ZepRNAi载体构建结果
• 3.2.1 目的片段的扩增与测序结果
• 3.2.2 中间载体的构建结果
• 3.2.3 RNAi表达载体的鉴定
• 3.3 ZEPAE载体构建结果
• 3.3.1 目的片段的扩增与测序结果
• 3.3.2 ZepAE载体的鉴定
• 3.4 载体质粒转化农杆菌EHA105结果
• 3.5 玉米茎尖生长点转化结果
• 3.5.1 除草剂筛选结果
• 3.5.2 部分转ZepRNAi载体抗除草剂植株的PCR检测
• 4. 小结
• 5. 讨论
• 5.1 以茎尖生长点为受体的原位转化
• 5.2 关于基因表达调控手段
• 5.2.1 基因的过表达
• 5.2.2 反义mRNA抑制技术
• 5.2.3 RNAi技术相关问题
• 5.3 对后续实验的建议
• 6. 参考文献
• 致谢