马铃薯青枯病抗性SRAP标记的筛选及蛋白酶抑制子Ⅰ基因片段的克隆

论文摘要

青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的细菌性土传病害，在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生，寄主范围涉及44科300多种植物，其中包括很多重要的经济作物，如马铃薯、番茄、花生和烟草。青枯病作为马铃薯的主要病害，常年在我国南方、西南和中原地区流行。迄今为止，马铃薯栽培种中尚未发现有效的青枯病抗源，仅在一些二倍体野生种和原始栽培种中存在有青枯病抗性，其中原始栽培种Solanum plureja具有高抗特性，成为马铃薯抗青枯病育种的主要抗性来源。但由于青枯病抗性表现出复杂的寄主、环境、病原小种的互作，因此对于青枯病抗性具体的遗传机制还不甚清楚。这一方面降低了田间抗性鉴定的效率和准确性，另一方面阻碍了抗病品种选育的进程。通过筛选与抗性基因或性状紧密连锁的分子标记，在育种过程中可以实现对抗性位点的直接选择，避免烦琐的田间接种鉴定，加速抗性基因的渗入和聚合，大大提高育种效率。另外，本实验室筛选的与青枯病抗性连锁的RAPD标记S27位于蛋白酶抑制子Ⅰ基因TATA-box上游约1500bp，因此蛋白酶抑制子类的基因可能在马铃薯青枯病防御中扮演着重要的角色。本试验利用具有青枯病抗性的原始栽培种S．phureja及野生种S．vernei所产生的2个二倍体分离群体（CE和ED），并采用新型标记SRAP技术，结合群分法（Bulked Segregant Analysis，BSA）策略，筛选与青枯病抗性紧密连锁的分子标记。结果显示，从88对引物组合中筛选得到一个与青枯病抗性连锁的SRAP标记M32。对于ED群体，标记M32与青枯病抗性位点的图谱距离为10.2cM。对于CE群体，标记M32与青枯病抗性位点的图谱距离为17.3cM。对M32的选择准确性发现，在ED群体中，标记M32选择的准确率为89.86％，在CE群体中，标记M32选择的准确率为83.33％。对于两个群体的总体准确率达到87.62％。根据检索得到的蛋白酶抑制子Ⅰ基因部分序列信息设计引物，通过特异PCR及TAIL-PCR技术克隆了该基因片段。该片段全长2214bp，Genescan分析显示，该片段包含2个外显子。氨基酸预测显示，克隆片段可能编码139个氨基酸，编码氨基酸序列两端与2个野生番茄和1个马铃薯的蛋白酶抑制子基因具有较高同源性，而在45～80的氨基酸序列与已有同类基因没有同源性，证实是一个新蛋白酶抑制子Ⅰ基因序列。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 国内外前人研究进展
• 1.2.1 青枯病病原（Ralstonia solanacearum）研究进展
• 1.2.1.1 Ralstonia solanacearum致病机理
• 1.2.1.2 Ralstonia solanacearum基因组分析
• 1.2.2 马铃薯青枯病抗性的遗传分析
• 1.2.3 马铃薯青枯病抗性的育种研究
• 1.2.3.1 2n配子的利用
• 1.2.3.2 体细胞杂交技术的应用
• 1.2.3.3 转基因技术的应用
• 1.2.4 SRAP标记原理及应用
• 1.2.4.1 SRAP标记引物设计原理
• 1.2.4.2 SRAP标记特征
• 1.2.4.3 SRAP标记的应用
• 1.2.5 马铃薯青枯病抗性分子标记的应用
• 1.2.6 蛋白酶抑制子基因研究进展
• 1.2.7 TAIL-PCR原理
• 1.3 本课题研究的目的与内容
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 群体材料的繁殖与保存
• 2.2.2 DNA提取及纯化
• 2.2.2.1 马铃薯基因组总DNA大量抽提法
• 2.2.2.2 马铃薯基因组总DNA小量抽提法
• 2.2.3 SRAP分析
• 2.2.3.1 SRAP引物
• 2.2.3.2 用群分法建立抗感DNA池
• 2.2.3.3 SRAP-PCR反应体系及反应程序
• 2.2.3.4 连锁分析
• 2.2.4 蛋白酶抑制子I基因的克隆
• 2.2.4.1 DNA模板材料
• 2.2.4.2 蛋白酶抑制子I基因部分序列的特异PCR扩增
• 2.2.4.3 蛋白酶抑制子基因序列的TAIL-PCR扩增
• 2.2.5 PCR扩增产物分析
• 2.2.6 PCR扩增片段的回收及克隆
• 2.2.6.1 PCR扩增片段的回收
• 2.2.6.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6.3 PCR扩增片段的克隆
• 2.2.7 PCR扩增片段的测序
• 2.2.8 生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 青枯病抗性分子标记的筛选
• 3.1.1 抗病基因池和感病基因池的构建
• 3.1.2 SRAP标记筛选
• 3.1.2.1 引物在亲本及抗感基因池中的 PCR扩增
• 3.1.2.2 引物me3-em2在ED和CE群体中的PCR扩增
• 3.1.2.3 标记M32在ED群体和CE群体中的连锁分析
• 3.1.2.4 SRAP标记M32的信息分析
• 3.2 蛋白酶抑制子I基因的克隆
• 3.2.1 蛋白酶抑制子I基因的克隆策略
• 3.2.2 蛋白酶抑制子I基因序列的特异 PCR扩增
• 3.2.3 蛋白酶抑制子I基因的测序与生物信息分析
• 3.2.3.1 PI-2214核酸序列分析及基因预测
• 3.2.3.2 PI-2214与已知部分蛋白酶抑制子I基因的同源性分析
• 4 讨论
• 4.1 影响群分法（BSA）准确性的因素
• 4.2 SRAP标记的有效性
• 4.3 TAIL-PCR基因克隆
• 4.4 蛋白酶抑制子I基因与植物抗性
• 参考文献
• 附录 1:标记 M32与田间鉴定*的共分离情况统计
• 附录 2.克隆基因序列与已知蛋白酶抑制子基因核酸序列比较
• 致谢