Toll样受体4介导BCG/LPS诱导免疫性肝损伤的机制及芍药苷的作用

论文摘要

肝损伤是各种肝病共同的病理基础，其病理特点为肝细胞变性、坏死，甚至凋亡。各种刺激因素包括生物性和化学性均可引起肝内细胞的激活，通过一系列信号级联反应分泌大量炎症免疫相关细胞因子，经过各种不同细胞与细胞因子相互之间的复杂作用，最终导致肝细胞损伤，从而丧失了肝脏的正常功能，迁延日久，发展成为肝纤维化。因此，及时控制肝损伤的发生和发展对治疗肝病将有重要的临床意义。 先天性免疫是机体抵御细菌、真菌和病毒等病原体感染的第一道重要防线。近年研究表明，Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是识别病原体的重要受体，在启动先天免疫反应以及随后的获得性免疫反应中发挥主导作用。研究发现TLR4信号通路参与激活肝内枯否细胞、肝细胞和星状细胞等多种细胞，分泌大量炎症免疫相关细胞因子，并在肝损伤的发生和发展过程中发挥重要作用。由于发生这些变化的机制十分复杂，目前尚不清楚，也无满意的治疗药物。因此，深入研究肝损伤分子机制，寻找新的拮抗肝损伤的药物具有重要医学意义。 芍药苷（paeoniflorin,Pae）为白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）中的主要成分。本课题组以往的研究发现，TGP具有抗炎、抗氧化、免疫调节和抗肝损伤等作用。本研究采用卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）和脂多糖

论文目录

• 英文缩略词对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 实验一 Toll样受体4介导BCG／LPS诱导免疫性肝损伤的机制
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 药物与试剂
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 动物
• 2.4 BCG和LPS诱导免疫性肝损伤模型的制备
• 2.5 实验分组与标本采集处理
• 2.6 ILI小鼠血清ALT活性测定
• 2.7 ILI小鼠肝组织病理学检查
• 2.7.1 肝组织固定与切片
• 2.7.2 病理组织学观察及分级标准
• 2.8 ILI小鼠肝组织细胞TNF-α、IL-6、TLR4、LBP和CD14mRNA转录水平的检测
• 2.8.1 总RNA提取
• 2.8.2 RNA的定性与定量分析
• 2.8.3 RT-PCR检测TNF-α、IL-6、TLR4、LBP和CD14mRNA水平
• 2.9 ILI小鼠肝组织细胞胞浆蛋白IκB-α的Western blot分析
• 2.9.1 蛋白提取
• 2.9.2 Lowry法检测蛋白
• 2.9.3 Western blot检测肝组织细胞胞浆蛋白IκB-α水平
• 2.10 ILI小鼠肝组织CD14和NFκBp65免疫组化检测
• 2.11 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 ILI小鼠肝脾指数的变化
• 3.2 ILI小鼠血清ALT活性的变化
• 3.3 ILI小鼠肝脏病理组织学的变化
• 3.4 ILI小鼠肝组织细胞TNF-αmRNA转录水平的变化
• 3.5 ILI小鼠肝组织细胞IL-6mRNA转录水平的变化
• 3.6 ILI小鼠肝组织细胞TLR4mRNA转录水平的变化
• 3.7 ILI小鼠肝组织细胞LBPmRNA转录水平的变化
• 3.8 ILI小鼠肝组织细胞CD14mRNA转录水平的变化
• 3.9 ILI小鼠肝组织CD14和NFκBp65表达水平的变化
• 3.10 ILI小鼠肝组织细胞胞浆蛋白IκB-α表达水平的变化
• 4 讨论
• 4.1 ILI小鼠血清ALT活性显著升高,肝组织呈现变性坏死
• 4.2 ILI小鼠肝组织细胞TNF-α和IL-6mRNA转录水平的升高是ILI的重要特点之一
• 4.3 ILI小鼠肝组织细胞TLR4、LBP和CD14mRNA转录和核蛋白NFκBp65表达水平的升高是ILI的重要机制之一
• 5 结论
• 6 参考文献
• 实验二 芍药苷对小鼠ILI的作用及其调节TLR4信号转导的部分机制
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 动物
• 2.2 药物与试剂
• 2.3 仪器与设备
• 2.4 Pae对小鼠ILI的保护作用
• 2.4.1 小鼠ILI模型的制备
• 2.4.2 动物分组、给药方案与标本采集处理
• 2.4.3 血清ALT活性的测定
• 2.4.4 血清TNF-α含量的测定
• 2.4.5 肝脏病理组织学观察及评分标准
• 2.5 Pae对ILI小鼠肝组织细胞TNF-α、IL-6、TLR4、LBP和CD14mRNA转录水平的影响
• 2.6 Pae对ILI小鼠肝组织细胞蛋白表达水平的影响
• 2.7 Pae对BCG／LPS处理的小鼠肝细胞功能的影响
• 2.7.1 肝细胞的分离与培养
• 2.7.2 肝细胞培养上清液ALT活性的测定
• 2.8 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 Pae对小鼠ILI的保护作用
• 3.1.1 Pae对ILI小鼠肝脾指数的影响
• 3.1.2 Pae对ILI小鼠血清ALT水平的影响
• 3.1.3 Pae对ILI小鼠血清TNF-α水平的影响
• 3.1.4 Pae对ILI小鼠肝脏病理组织学的影响
• 3.2 Pae对ILI小鼠肝组织细胞TNF-α、IL-6、TLR4、LBP和CD14mRNA转录水平的调节作用
• 3.2.1 Pae对ILI小鼠肝组织细胞TNF-αmRNA转录水平的影响
• 3.2.2 Pae对ILI小鼠肝组织细胞IL-6mRNA转录水平的影响
• 3.2.3 Pae对ILI小鼠肝组织细胞TLR4 mRNA转录水平的影响
• 3.2.4 Pae对ILI小鼠肝组织细胞LBP mRNA转录水平的影响
• 3.2.5 Pae对ILI小鼠肝组织细胞CD14mRNA转录水平的影响
• 3.3 Pae对ILI小鼠肝组织蛋白表达水平的调节作用
• 3.3.1 Pae对ILI小鼠肝组织CD14表达水平影响
• 3.3.2 Pae对ILI小鼠肝组织细胞胞浆蛋白IκB-α和核蛋白NFκBp65表达水平的影响
• 3.3.3 Pae对ILI小鼠肝组织NFκBp65表达水平的影响
• 3.4 Pae对BCG／LPS处理的小鼠肝细胞功能的影响
• 4 讨论
• 4.1 Pae对BCG／LPS诱导的小鼠ILI具有保护作用
• 4.1.1 Pae对ILI小鼠肝功能的改善作用
• 4.1.2 Pae减轻ILI小鼠肝组织病理损伤
• 4.2 下调ILI小鼠肝组织TNF-αmRNA和上调IL-6mRNA转录水平是Pae拮抗ILI的重要特点之一
• 4.3 下调ILI小鼠肝组织TLR4、LBP、CD14mRNA转录和上调NFκBp65表达水平可能是Pae拮抗ILI的主要机制之一
• 5 结论
• 6 参考文献
• 本研究创新点
• 附录
• 致谢
• 综述：TLRs信号转导通路及其药物作用的研究进展