弹性蛋白酶发酵生产条件优化及性质研究

论文摘要

弹性蛋白酶（Elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶,能降解弹性硬蛋白,并且对酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都具有分解能力,因此可用来作为肉类嫩化剂。另外,弹性蛋白酶还可以降解肉类中难以处理、食用的韧带、大动脉管以及筋腱等蛋白质废料,利于提高肉的利用率。响应曲面法（ response surface methodology, RSM）是统计设计实验技术的合成,它采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺,解决多变量问题。本课题研究的主要内容是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为产弹性蛋白酶菌株,根据在不同摇瓶发酵培养条件下,该菌所产弹性蛋白酶水解能力的大小,应用响应面法来确定最利于枯草芽胞杆菌发酵产弹性蛋白酶的条件。同时对得到的弹性蛋白酶的性质进行初步研究。研究中,首先,通过预实验确定最利于枯草芽孢杆菌发酵产弹性蛋白酶的培养条件:最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为酵母膏,最佳金属离子组合为K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O。然后,通过单因素实验以及双因素重复实验,确定葡萄糖、酵母膏、葡萄糖和酵母膏的交互作用、金属离子、温度、pH值以及接种量的取值范围,并对以上各个因素进行方差分析,确定葡萄糖、酵母膏、温度及pH值四个因素为影响显著的因素。最后,对影响显著的因素应用二次回归正交旋转组合设计安排试验,得到回归方程。对得到的回归方程应用SAS软件进行分析,得到最利于枯草芽孢杆菌摇瓶发酵产弹性蛋白酶的培养条件为:1.5%葡萄糖、1.5%酵母膏、0.1%K2HPO4、0.05%KH2PO4、0.01%MgSO4·7H2O,起始pH为6.5,最适发酵温度为36.5℃,接种量4%。通过验证实验证明得到的回归方程是可靠的,得到的各个参数值在实际应用中是可行的。同时,对所得到的弹性蛋白酶的热稳定性、酸碱稳定性、最适作用温度、最适作用pH值、金属离子以及盐析的影响进行了初步的研究,得到的结论如下:由枯草芽孢杆菌发酵得到的弹性蛋白酶在低温下稳定性较好;在pH接近于中性的条件下稳定性较好;在碱性条件下水解能力较好:在Tris-HCl缓冲液中最适pH为8.2,在硼砂-硼酸缓冲液中最适pH为7.8;弹性蛋白酶的最适作用温度为50℃;金属离子对枯草芽孢杆菌生产的弹性蛋白酶的水解能力影响不明显;弹性蛋白酶的分级沉淀确定在20%～65%。将实验得到的弹性蛋白酶粗酶应用于对猪肉及主动脉的嫩化,发现在50℃条件下,4%左右添加量的酶与猪肉及主动脉作用1h,嫩化的效果较好,这与弹性蛋白酶性质研究部分实验所得的结论相一致

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 本课题的立题背景
• 1.2 弹性蛋白酶的特性
• 1.3 弹性蛋白酶的来源
• 1.3.1 弹性蛋白酶的微生物来源
• 1.3.2 弹性蛋白酶的其他来源
• 1.4 弹性蛋白酶的应用
• 1.4.1 弹性蛋白酶在医药学中的应用
• 1.4.2 弹性蛋白酶在食品工业中的应用
• 1.4.3 弹性蛋白酶在日用化工方面的应用
• 1.4.4 弹性蛋白酶的其它应用
• 1.5 弹性蛋白酶的研究现状与发展前景
• 1.5.1 弹性蛋白酶的研究现状
• 1.5.2 微生物产弹性蛋白酶的问题及发展前景
• 1.6 课题的先进性和预期效果
• 1.7 本课题的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 实验材料与试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 培养基与培养方法
• 2.2.1 种子斜面培养基
• 2.2.2 种子培养基
• 2.2.3 液体发酵基础培养基
• 2.3 枯草芽孢杆菌培养条件对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.1 弹性蛋白酶水解能力的测定方法
• 2.3.2 菌体生长曲线的测定
• 2.3.3 酸度的测定
• 2.3.4 碳源对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.5 氮源对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.6 金属离子对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.7 碳源、氮源及二者的交互作用对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.8 磷酸氢二钾对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.9 磷酸二氢钾对产弹性蛋白酶酶的影响
• 2.3.10 硫酸镁对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.11 温度对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.12 起始pH 对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.13 接种量对产弹性蛋白酶的影响
• 2.3.14 响应面实验设计
• 2.4 弹性蛋白酶性质的初步研究
• 2.4.1 弹性蛋白酶粗酶的获得
• 2.4.2 弹性蛋白酶水解能力的测定方法
• 2.4.3 酸碱度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 2.4.4 温度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 2.4.5 弹性蛋白酶的最适pH 值
• 2.4.6 弹性蛋白酶最适作用温度
• 2.4.7 金属离子对弹性蛋白酶的影响
• 2.4.8 盐析对弹性蛋白酶的影响
• 2.5 弹性蛋白酶对肉类嫩化作用的研究
• 2.5.1 弹性蛋白酶粗酶的提取方法
• 2.5.2 弹性蛋白酶水解能力的测定方法
• 2.5.3 肉嫩度的测定方法
• 2.5.4 扫描电镜观察的方法
• 2.5.5 不同温度下弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 2.5.6 不同时间弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 2.5.7 不同添加量时弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 3 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌培养条件对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.1 菌株摇瓶发酵的变化
• 3.1.2 碳源对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.3 氮源对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.4 金属离子对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.5 碳源、氮源及二者的交互作用对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.6 磷酸氢二钾对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.7 磷酸二氢钾对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.8 硫酸镁对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.9 温度对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.10 起始pH 值对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.11 接种量对产弹性蛋白酶的影响
• 3.1.12 响应面实验设计及结果
• 3.2 弹性蛋白酶性质的初步研究
• 3.2.1 酸碱度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 3.2.2 温度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 3.2.3 弹性蛋白酶的最适pH 值
• 3.2.4 弹性蛋白酶最适作用温度
• 3.2.5 金属离子对弹性蛋白酶的影响
• 3.2.6 盐析对弹性蛋白酶的影响
• 3.3 弹性蛋白酶对肉类嫩化作用的研究
• 3.3.1 不同温度下弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 3.3.2 不同时间弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 3.3.3 不同添加量时弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用
• 4 讨论
• 4.1 枯草芽孢杆菌培养条件对产弹性蛋白酶的影响
• 4.1.1 菌株摇瓶发酵的变化
• 4.1.2 碳源对产弹性蛋白酶的影响
• 4.1.3 金属离子对产弹性蛋白酶的影响
• 4.1.4 磷酸氢二钾对产弹性蛋白酶的影响
• 4.1.5 温度对产弹性蛋白酶的影响
• 4.1.6 起始pH 值对产弹性蛋白酶的影响
• 4.2 弹性蛋白酶性质的初步研究
• 4.2.1 酸碱度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 4.2.2 温度对弹性蛋白酶水解能力的影响
• 4.2.3 弹性蛋白酶最适作用温度
• 4.2.4 金属离子对弹性蛋白酶的影响
• 5 结论
• 5.1 研究的主要结论
• 5.2 进一步研究的建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文