低温条件下黑龙江林蛙肝脏蛋白及代谢酶的适应性变化

论文摘要

黑龙江林蛙（Rana amurensis），主要分布于我国东北地区。由于东北地区冬季气候寒冷干燥，黑龙江林蛙越冬时要面临严峻的低温威胁和生存压力，因而作为北方耐寒两栖类，其耐寒的生物学特性具有较高的研究价值。本文旨在研究低温条件下黑龙江林蛙肝脏蛋白质、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PDH）及酯酶（EST）的适应性变化，以探讨黑龙江林蛙冬眠期低温耐受的机制，为两栖类低温生物学和比较生理学的深入研究提供理论参考和实验依据。本试验选取黑龙江省伊春地区黑龙江林蛙为研究材料，观察黑龙江林蛙在环境温度为室温（14℃）、1℃和-2℃条件下的存活率，并采用2-D native-PAGE／SDS-PAGE电泳、酶活性比色法、同工酶电泳等生化技术检测不同温度环境下肝脏蛋白质及代谢酶的活性变化。试验结果表明：室温组和1℃组黑龙江林蛙72h的存活率为100％，-2℃组24h的存活率为84.6％。但用酶活性比色法观察上述三种环境温度下肝脏LDH酶活性并无显著差异（P＞0.05）；而-2℃组和1℃组SOD酶活性显著高于室温组（P＜0.05），其中1℃组SOD酶活性变化极显著（P＜0.01）。在此基础上测定1℃组及室温组G6PDH及EST同功酶活性及肝脏蛋白变化。同功酶电泳图谱显示，1℃组与室温组黑龙江林蛙肝脏LDH酶活性差异不显著，均以LDH-5为主，但1℃组LDH-1显著高于室温组（P＜0.05），推测黑龙江林蛙为适应低温低氧环境，增强LDH-1酶活性以较好的利用乳酸，避免因大量乳酸形成造成肝脏疲劳；而1℃组肝脏G6PDH酶活性无显著变化，进一步说明低温条件下葡萄糖戊糖途径和糖酵解作用的互相协调，维持机体代谢的稳定；1℃组和室温组EST总酶比活力无显著变化，但1℃组中Rf=0.17和Rf=0.72的EST同工酶显著升高（P＜0.05），推测在低温条件下黑龙江林蛙可能通过选择性增强部分酯酶同功酶活性，增加肝脏酯类物质代谢，为机体提供维持生命必需的最低能量。黑龙江林蛙肝脏蛋白电泳显示，胶浓度6％的肝脏PAGE图谱分辨率高、谱带多，可分辨出15～19条谱带，其中1℃组Rf=0.79蛋白含量比室温组显著增加（P＜0.05）。2-D native-PAGE／SDS-PAGE电泳时，胶浓度为12％时分离效果较好，蛋白斑点较多。1℃组中P蛋白斑点（MW=51kDa，一向PAGE的Rf=0.47）显著性上调（P＜0.05），N蛋白斑点（MW=65kDa，一向PAGE的Rf=0.94）显著性下调（P＜0.05），推测这两种蛋白可能与黑龙江林蛙在低温环境下的适应性变化有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 绪论
• 1.1 生物体低温条件下的体温调节
• 1.2 变温动物的低温耐受调节机制
• 1.2.1 适应策略
• 1.2.2 结冰激活蛋白
• 1.2.3 抗冻保护剂
• 1.2.4 抗氧化能力
• 1.2.5 低温诱导基因表达
• 1.2.6 代谢阻滞和蛋白降解的抑制
• 1.2.7 低温生物学相关技术进展
• 1.2.8 两栖类低温耐受的研究模型
• 1.3 国内两栖类低温耐受的研究
• 1.3.1 两栖类冬眠的相关研究
• 1.4 肝脏在体温调节中的作用
• 1.5 2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳技术
• 1.6 课题设计
• 1.6.1 本研究立题依据
• 1.6.2 预期目标
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 试剂配制
• 2.4 试验材料
• 2.5 低温条件及其持续时间对黑龙江林蛙存活率的测定
• 2.6 黑龙江林蛙肝脏SOD、LDH、G6PDH及EST的测定
• 2.6.1 SOD酶活性检测
• 2.6.2 LDH酶活力检测
• 2.6.3 LDH、G6PDH、EST同工酶电泳
• 2.7 黑龙江林蛙肝脏蛋白的聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳
• 2.8 黑龙江林蛙肝脏蛋白的2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳
• 2.9 本章小结
• 3 结果
• 3.1 低温条件下黑龙江林蛙存活率比较
• 3.2 低温条件下黑龙江林蛙几种酶活性分析
• 3.2.1 SOD、LDH酶活性分析
• 3.2.2 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏LDH同工酶图谱
• 3.2.3 室温组和1℃组黑龙江林蛙G6PDH同工酶图谱
• 3.2.4 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏EST同工酶图谱
• 3.3 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏蛋白PAGE电泳图谱
• 3.3.1 PAGE分离胶浓度选择
• 3.3.2 TotalLab v2005图像分析软件分析6%浓度分离胶PAGE电泳图
• 3.3.3 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏蛋白PAGE电泳图谱比较分析
• 3.4 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏蛋白2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳图谱分析
• 3.4.1 2-D native-PAGE/SDS-PAGE重现性
• 3.4.2 2-D native-PAGE/SDS-PAGE分离胶选择
• 3.4.3 一向PAGE图谱与2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳图对应分析
• 3.4.4 室温组和1℃组黑龙江林蛙肝脏2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳图谱比较分析
• 3.5 本章小结
• 4 讨论
• 4.1 黑龙江林蛙耐低温能力
• 4.2 黑龙江林蛙肝脏几种酶活性分析
• 4.2.1 SOD酶活性分析
• 4.2.2 LDH酶活性分析
• 4.2.3 G6PDH酶活性分析
• 4.2.4 EST酶活性分析
• 4.3 黑龙江林蛙肝脏蛋白PAGE电泳图谱分析
• 4.4 黑龙江林蛙肝脏蛋白2-D native-PAGE/SDS-PAGE电泳分析
• 4.4.1 电泳条件
• 4.4.2 影响因素
• 4.5 黑龙江林蛙肝脏蛋白质电泳图谱的变化区域分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢