透明颤菌血红蛋白结构和功能研究

论文摘要

生物进化到以氧气为基础的代谢是高度适应性的表现,在进化过程中,卟啉蛋白的出现使有氧代谢过程不再受氧气在水中溶解度的限制。卟啉蛋白在生物体内除与氧分子结合并参与氧的存储与运输外,还能参与电子传递及信号传导过程。血红蛋白是一重要的氧结合蛋白,几乎普遍存在于动物、植物和微生物中。20世纪70年代,美国科学家Tyree等人在专性好氧菌透明颤菌中发现了可溶性血红蛋白一一透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin, VHb）。1974年,WebsterDA等人从Vitreoscilla sp.中提取纯化得到VHb。其后在1986年Wakabayashi S等首先确定了VHb的氨基酸序列。1988年,Webster DA获得了VHb的编码基因vgb,完整的vgb基因大约为500 bp,并成功实现了VHb在大肠杆菌中的异源表达。1989年,Khosla C和Bailey JE在研究vgb基因在基因工程菌大肠杆菌中的表达过程中发现vgb基因表达是受氧调控的。同年,Khosla C等又一次发现vgb基因的表达除了受氧调控外,还受到cAMP-CAP复合物的调控。1994年,竺嘉对VHb的氧调控机制补充,提出VHb的氧调控与FNR调控蛋白有关,并建立了FNR蛋白调控vgb基因的作用模式图。VHb使细菌在低氧条件下生存的作用机制还不完全清楚,目前仍处于假说状态,即1966年Wittenberg C提出的扩散促进假说,1990年,Khosla C等提出的胞内氧化还原效应物假说,和1997年吴奕提出的末端受体假说。现有的大多证据表明,VHb与氧结合形成氧合态,并以氧合态参与氧有关的代谢,介入细胞与氧有关的代谢途径中的某些关键步骤,通过将氧传递给呼吸链,调节末端氧化酶活性,改变磷酸化效率,最终影响某些基因的翻译,改变蛋白的表达。在低氧条件下,VHb的生理机能及其调控机制的研究依然是研究的热点。为研究VHb生理功能与分子作用机制,我们构建了VHb的表达体系,先是从体外研究着手,通过控制环境中氧的浓度对VHb进行低氧诱导表达,并且对纯化条件改造与探索,首次通过分离纯化获得了脂结合的VHb与非脂结合的VHb,利用光谱学技术,对VHb的上述两种样品的结构和功能进行了深入研究,研究表明脂结合的VHb比非脂结合的VHb有更高的过氧化氢酶活性,结合Rinaldi等人2006年体外重组实验发现的脂结合VHb氧结合能力是非脂结合VHb氧结合能力的二十分之一,我们提出在宿主细胞内,VHb的生理功能是可以通过脂结合调节的。透明颤菌血红蛋白表达载体的构建,包括目的基因与启动子的连接,重组质粒的构建。载体构建的设计为不含组氨酸标签的野生型蛋白vgb基因,与VHb的天然启动子共同连接到表达型载体pUC19中。研究表明vgb基因只有在其天然启动子的启动下才能开启目的基因的转录和翻译,使用不含组氨酸标签和任何突变的vgb基因,可以保证VHb在天然的生理环境中表达,研究VHb在胞内的真实生理功能。双酶切验证和测序结果证明了重组质粒目的基因及其连接方向的正确性。将已得到的重组质粒转入大肠杆菌E. coli BL21 （DE3）中,通过探索和改造重组菌的诱导表达及分离纯化,得到了SDS-PAGE一条带,Rz>3的目的蛋白。实验结果表明,分离纯化得到了Soret带分别为406 nm和402 nm的VHb的两种不同结合形式蛋白,即VHb（406）和VHb（402）。SDS-PAGE结果指出两种样品的分子量大小均为16 KD,N-末端分析证明他们的N-末端均为Met,这与报道的天然VHb的N-末端是相一致的。紫外可见吸收光谱表明VHb（402）和VHb（406）都是带有卟啉的蛋白,且具有相当高的结构相似性。因此证明VHb（402）和VHb（406）为同一蛋白,是VHb的两种不同结合形式。利用紫外可见吸收光谱技术,在波长240-750 nm条件下深入研究了VHb（406）与VHb（402）的结构和功能的关系。在紫外可见吸收光谱中,VHb（406）在626 nm有一个特征吸收峰,而VHb（402）的特征吸收峰在644 nm,在2006年,Rinaldi等人在VHb体外重组实验中同样看到该信号并且指出两种信号分别为脂结合和非脂结合VHb,在2003年,Bonamore A等人在其它蛋白中也看到了相似信号。因此推论VHb（406）为VHb的脂结合状态,VHb（402）为VHb的非脂结合状态。脂结合VHb的卟啉特征吸收Soret带（406 nm）与蛋白的特征吸收（280 nm）的比值（"Reinheit Zahl" Rz）为3.30,非脂结合VHb的Rz值为3.15,脂结合VHb和非脂结合VHb的Rz均大于3,SDS-PAGE电泳一条带,说明两种样品卟啉并没有明显丢失,可以进行含卟啉蛋白的结构和功能的测试与分析。结合园二色谱和拉曼光谱结果,发现脂结合VHb比非脂结合VHb拥有更多的α-螺旋,脂结合VHb和非脂结合VHb样品的υ4振动均在1375 cm-1处显示为纯而较强的信号,指征两种样品中铁卟啉均处于三价铁氧化态。脂结合VHb和非脂结合VHb样品的υ（C=C）振动分别处于1632 cm-1和1630 cm-1,这表明脂结合和非脂结合两种条件下VHb卟啉分子的乙烯基团均处于顺式。以L-dopa和H2O2为底物探究VHb的过氧化氢酶活性,结果表明脂结合VHb比非脂结合VHb有更高的过氧化氢酶活性,VHb是细胞氧调节器,并且它的过氧化氢酶活性是受脂结合调控的。在1992年Dikshit KL及Webster DA等人提出在正常生理机能的条件下,VHb（Fe2+）催化过氧化氢产生能够提高宿主菌氧化呼吸链的速率,而在2010年,Anand等人指出当VHb在宿主细胞中诱导过氧化氢产生时VHb的表达受到抑制,即过氧化氢的产生不是胞内的正常生理机能,两种模型的差异可能是来自于VHb具有脂结合和非脂结合的两种状态,这两种状态与氧反应能力不同是上述模型差异的主要来源。我们对透明颤菌血红蛋白的过氧化氢酶酶学性质进行研究,并与Mb进行比较,它们一级序列和空间结构具有很高的同源性。研究表明,VHb对L-dopa的亲和力大于对过氧化氢的亲和力,在25℃,pH 7.5的条件下以L-dopa和过氧化氢为底物时,在相同卟啉浓度下VHb的比活为Mb的比活的10倍左右。以L-dopa为底物检测VHb温度相关过氧化氢酶酶活性时,60℃pH 7.5条件下VHb具有最大过氧化物酶活性,活性半衰期大于30 h,温度高于60℃时半小时内VHb的过氧化物酶活性迅速丧失；DSC实验表明VHb的相转变温度为82℃,即酶活性的丧失与蛋白变性无关。紫外-可见吸收光谱和拉曼光谱研究表明,VHb的过氧化物酶活性主要来自于其卟啉铁的六配位低自旋状态及其扭曲的卟啉环平面构象。卟啉分子在蛋白内的构象维系与卟啉周围的蛋白微区结构相关。在1984年,Ignarro指出,卟啉的丙酸侧链通过电负性末端与卟啉蛋白的电正性氨基酸残基形成盐桥从而稳定卟啉与卟啉蛋白的结合,从VHb的三维结构fPDB为1VHB)可以看出,VHb的heme b丙酸侧链是指向D-loop区域的,结合VHb的温度相关酶活性研究和DSC实验结果可以推测,D-loop区域中43-53肽段内的氨基酸不是处于完全的自由状态,而是存在稳定heme b丙酸侧链的氨基酸残基,并稳定卟啉的扭曲构象及保持其铁原子处在氧化态的六配位低自旋的结构。这部分氨基酸残基与卟啉丙酸的相互作用在60℃附近出现较为彻底的破坏,而此温度下,VHb的整体三维结构还保持了相当的完整性。本论文中,我们着重研究了VHb表达载体的构建,分离纯化,脂结合和非脂结合的VHb结构和功能,以及化学和物理因素对VHb酶活性的影响,为进一步阐释VHb的生理功能与分子作用机制及其结构和功能,提供了技术保障和理论依据。

论文目录

中文摘要

Abstract

英文缩写词

第1章绪论

1.1 透明颤菌血红蛋白（VHb）的发现和最初研究

1.2 VHb的基因调控机制

1.3 透明颤菌血红蛋白的表达

1.4 透明颤菌血红蛋白的结构与空间定位

1.5 透明颤菌血红蛋白生理功能的研究

1.6 透明颤菌血红蛋白及基因的应用

1.6.1 VHb在植物代谢工程中的应用

1.6.2 VHb在发酵工程中的应用

1.6.3 VHb降解毒害作用

1.7 本课题的立题意义和研究内容

参考文献

第2章透明颤菌血红蛋白表达载体构建

2.1 前言

2.2 实验仪器材料和试剂

2.2.1 实验仪器

2.2.2 菌种与质粒

2.2.3 实验试剂及配置方法

2.2.4 酶和其它试剂及来源

2.3 实验设计

2.3.1 vgb基因的扩增

2.3.2 VHb的厌氧启动子的设计与研究

2.3.3 基因与厌氧启动子的链接

2.3.4 构建含vgb基因及厌氧启动子的pUC19质粒

2.3.5 重组质粒的鉴定

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 目的基因的PCR结果

2.4.2 重组质粒的提取

2.4.3 双酶切验证pUCm-T重组质粒

2.4.4 测序验证基因插入方向

2.4.5 pUC57+promoter+vgb的构建与验证

2.4.6 pUC19+promoter+vgb的构建与验证

2.4.7 测序验证

2.5 小结

参考文献

第3章透明颤菌血红蛋白的厌氧表达及纯化

3.1 前言

3.2 实验仪器材料和试剂

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂及配置方法

3.3 实验设计

3.3.1 VHb的表达

3.3.2 蛋白纯化

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 蛋白表达的检测

3.4.2 硫酸铵沉淀

3.4.3 还原态样品制备

3.4.4 离子交换层析

3.4.5 凝胶过滤层析

3.4.6 SDS-PAGE

3.4.7 VHb分离纯化的纯度和收率

3.5 小结

参考文献

第4章脂结合和非脂结合的透明颤菌血红蛋白的特性及功能研究

4.1 前言

4.2 实验仪器材料和试剂

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验试剂及配置方法

4.3 实验设计

4.3.2 蛋白的纯化

4.3.3 紫外可见吸收光谱

4.3.4 园二色谱

4.3.5 拉曼光谱

4.3.6 过氧化氢酶活性测定

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 脂结合和非脂结合VHb的紫外可见吸收光谱

4.4.2 脂结合和非脂结合VHb的园二色谱的测定

4.4.3 透明颤菌血红蛋白的三级结构

4.4.5 脂结合和非脂结合的透明颤菌血红蛋白的拉曼光谱的测定

4.4.6 基本酶学特性参数

4.5 小结

参考文献

第5章化学和物理因素影响透明颤菌血红蛋白酶活性的研究

5.1 前言

5.2 实验仪器材料和试剂

5.2.1 实验仪器

5.2.2 实验试剂及配置方法

5.2.3 其它试剂

5.3 实验设计

5.3.1 过氧化氢酶活性测定

5.3.2 pH相关过氧化物酶活性测定

5.3.3 温度相关过氧化物酶活性测定

5.3.4 动力学测定

5.3.5 差示量热测定

5.4 实验结果与讨论

5.4.1 VHb的pH相关过氧化氢酶活性

5.4.2 VHb的温度相关过氧化氢酶活性

5.4.3 VHb与Mb的动力学研究

5.4.4 VHb与Mb米氏常数的测定

5.4.5 VHb的热转变温度测定

5.5 小结

参考文献

第6章总结

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

透明颤菌血红蛋白结构和功能研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢