不同环境下三种治法对甲3亚型流感病毒（H3N2）感染小鼠治疗干预作用研究

论文摘要

流感病毒是严重威胁人类健康的一种病原体，它能导致流感流行甚至世界大流行，流感在各个年龄阶段的人群中都可能爆发而引起急性发热性呼吸道疾病。1997年香港第一起人类禽流感事件发生以来，不断有人感染高致病性禽流感病毒H5N1死亡的报道，流感病毒再次向人类展示了它的巨大“威力”。甲3亚型流感病毒（H3N2）属于甲型流感病毒的一个亚型，1968年最早出现于香港，后传播到日本、美国等地，引发了一场流感世界大流行。此后，虽未再次引起世界大流行，但散发流行至今。近年来，世界范围的流感流行病学监控和调查分析显示，该亚型流感病毒在全球是流行优势株，国内和广东省的调查也显示相同的趋势。本文从甲3亚型流感病毒的现代研究、机体抗流感病毒免疫研究、中医药抗流感病毒实验研究、中医对流感的认识及外感病理论研究等方面进行了综述。无论是甲3亚型流感病毒的国际流行株，还是国内及广东省的流行株，均发生了抗原漂移。由于监测毒株的抗原性变化对预防流感流行及疫苗的研制有重要意义，因此目前国外和国内相关机构对甲3亚型毒株的抗原性变化进行了大量深入的研究，努力揭示了毒株抗原漂移的分子生物学机制。而在该亚型流感的治疗上，除了使用一些抗甲型流感的药物外，没有新的研究进展。同时，甲3亚型毒株对现有抗流感药物产生耐药性的病例报道在不断增多。抗流感病毒疫苗被认为是预防流感最有效的方法，但由于流感病毒不断发生抗原漂移，疫苗的研制进程远滞后于毒株的变异速度，给甲3亚型流感的预防带来困难。流感在中医学中属外感病范畴，分别散见于温病中的“风温”、“春温”，以及伤寒的“太阳病”、“阳明病”、“少阳病”各型中。中医外感病理论有着悠久的历史和丰富的内容，其中包含了很多治疗流感行之有效的经典治法和方药。目前，中医药抗流感病毒实验研究正在积极地展开，包括了对单味药和对中药复方进行的体内和体外抗病毒研究。已经从对有效药物的筛选发展到对有效成分、有效部位的筛选；从单纯考察药物对流感病毒的直接抑制作用到考察药物对机体抗病毒免疫功能的影响。这些研究都取得了一定的成果，对指导中医临床防治流感起到了积极的作用。但现有的中医药抗流感病毒实验较多使用的是甲1亚型流感病毒，而对甲3亚型的研究相对较少。同时，现有中医药抗流感病毒实验缺乏具有中医特点的、能对中医药综合作用进行评价的系统研究方法，使得中医药治疗外感病辨证论治的优势得不到充分展示，不能更好地全面地说明中医药理论在治疗流感上的独特作用。本文实验研究部分是在对甲3亚型流感病毒A／昆科／1／71（H3N2）任株的血凝素（HA）基因进行核苷酸序列测定，对毒株进行基因水平鉴定的基础上，从体外细胞培养和体内整体动物实验两方面着手，把辛凉解表、辛温解表及祛湿解表等三种不同治法和常温环境、热环境和寒环境三种不同环境相结合来考查中药复方的抗流感病毒作用和免疫调节机制。体外实验观察三种治法代表方银翘散、桂枝麻黄各半汤和新加香薷饮在细胞培养中对甲3亚型流感病毒的抑制作用。体内实验在建立甲3亚型流感病毒感染小鼠模型的基础上，分别在三种环境条件下运用三种治法的代表方进行小鼠体内抗流感病毒实验，测定了相关药效学指标：肺指数和肺脏病理改变程度；相关免疫学指标：血清白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）以及外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+％，CD4+％，CD8+％）。测序结果表明，本实验所测得甲3亚型流感病毒A／昆科／1／71（H3N2）任株HA基因序列和Influenza A virus（A／Hong Kong／6／72（H3N2））最大同源性经BLAST服务器分析为99％。本次测序是该毒株自临床分离后首次进行的HA基因鉴定，第一次在基因水平上鉴定了该毒株的型别。体外实验结果表明，三种治法的代表方在体外细胞培养中对甲3亚型流感病毒均无明显的抑制作用。体内抗流感病毒实验结果表明：三种治法对小鼠甲3亚型流感肺炎均有一定的治疗干预作用，表现为减轻肺实变，降低肺指数、改善病毒性肺炎的病变程度等，但三种治法在不同环境下的作用有差异：辛凉解表法在常温和热环境下显示了较好的体内抗流感病毒作用，但在寒环境下无效。辛温解表和祛湿解表法在三种不同环境下的作用都比较稳定，均有较好的体内抗流感病毒作用。相关免疫指标检测结果：三种不同治法对甲3亚型流感病毒感染小鼠的免疫功能均有一定的调节作用，可以通过提高感染小鼠外周血中成熟T淋巴细胞和辅助性T细胞的百分比（CD3+（％）、CD4+（％））进而提高感染小鼠细胞免疫功能。也可以通过提高感染小鼠血清IL-2，降低血清TNF-α，调节感染小鼠体内保护性细胞因子IL-2和促炎细胞因子TRF-α之间的平衡，进而改善病毒感染小鼠免疫功能的紊乱，减轻病毒感染导致的免疫炎症损伤。但三种治法在不同环境下对感染小鼠免疫功能的调节作用有差异：辛凉解表法在热环境下能更好地提高感染小鼠细胞免疫功能，改善小鼠感染病毒后免疫功能的紊乱。辛温解表法在常温环境和寒环境下才具有提高感染小鼠细胞免疫功能，改善小鼠感染病毒后免疫功能的紊乱的作用。祛湿解表法在不同环境下提高细胞免疫功能和改善免疫功能紊乱的作用都很稳定。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 甲3亚型流感病毒（H3N2）现代研究
• 第一节 概述
• 第二节 甲3亚型流感病毒（H3N2）的流行病学研究
• 第三节 甲3亚型流感病毒（H3N2）的分子病毒学研究
• 第四节 甲3亚型流感的临床表现及实验室诊断
• 第五节 甲3亚型流感的预防和治疗
• 小结
• 第二章 抗流感病毒免疫机制研究
• 第一节 T细胞在流感病毒感染免疫应答和免疫调节中的作用
• 第二节 细胞因子在流感病毒感染中的作用
• 小结
• 第三章 中医药抗流感病毒实验研究
• 第一节 抗流感病毒实验方法
• 第二节 中医药抗流感病毒实验研究概况
• 小结
• 第四章 中医对流感的认识及外感病理论研究
• 第一节 中医对流感的认识
• 第二节 中医外感病理论研究
• 小结
• 第二部分 实验研究
• 第一章 实验研究的内容、技术路线和材料
• 第一节 研究内容
• 第二节 技术路线
• 第三节 实验材料
• 第二章 建立甲3亚型流感病毒（H3N2）感染动物模型
• 第一节 甲3亚型流感病毒HA基因序列的测定
• 第二节 甲3亚型流感病毒传代与体内外病毒滴度测定
• 第三节 甲3亚型流感病毒感染小鼠模型的建立
• 第三章 三种治法代表方体外抗甲3亚型流感病毒（H3N2）作用及对病毒感染小鼠的死亡保护作用
• 第一节 三种治法的代表方体外抗甲3亚型流感病毒作用
• 第二节 不同治法对小鼠感染甲3亚型流感病毒的死亡保护作用
• 第四章 不同环境下三种治法对小鼠感染甲3亚型流感病毒的治疗干预和免疫调节作用
• 第一节 不同环境下三种治法对小鼠甲3亚型流感肺炎的治疗干预作用
• 第二节 不同环境下三种治法对甲3亚型流感病毒感染小鼠血清IL-2、TNF-α的影响
• 第三节 不同环境下三种治法对甲3亚型流感病毒感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响
• 第五章 讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢