THAP11与PCBP1相互作用的分子机制及其生物学功能研究

论文摘要

THAP11属于新发现的THAP蛋白质家族成员。该家族因含有与果蝇P元件转座酶DBD高度同源的THAP结构域而得名。研究表明这是一类锌离子依赖的DNA结合蛋白质,广泛参与细胞增殖、凋亡调控,并可能与染色体修饰/重构相关。本实验室前期研究表明THAP11可通过直接结合c-Myc启动子区抑制c-Myc表达,进而抑制细胞生长。对其作用机制及进一步的功能研究尚无报道。为深入研究THAP11功能,我们以其相互作用蛋白质作为切入点,利用酵母双杂交技术,从成人肝脏cDNA文库中筛选到THAP11相互作用蛋白质PCBP1。PCBP1是核内不均一核糖核蛋白家族成员,具有RNA结合活性,可直接参与调控mRNA的可变剪接,提示THAP11可能也参与mRNA的剪接过程。本文首先利用免疫共沉淀技术,确定了THAP11与PCBP1的相互作用区域。鉴于CD44的可变剪接与肿瘤发生、发展的关系越来越明确,是研究可变剪接与人类疾病关系的经典模型,我们对两者在CD44 mRNA剪接中的作用进行了深入研究,发现PCBP1可抑制HepG2细胞内源及外源CD44可变剪接体的表达,而siRNA实验表明THAP11相对特异的抑制v3, v5、v6、v8等肿瘤发生相关的可变剪接体的表达,其功能发挥依赖于PCBP1。过表达THAP11可抑制由Ras激活引起的CD44可变剪接体v5、v6（CD44v5、v6）的上调,进而抑制肿瘤侵袭与转移,RNAi干涉掉内源THAP11后CD44v水平上升,HepG2侵袭能力增强。利用Real-time PCR分析发现,CD44v6与THAP11在临床肝癌病人组织中的表达存在负相关。以上结果表明THAP11可通过抑制CD44可变剪接进而抑制肝癌侵袭、转移,该蛋白与PCBP1的相互作用可能是其发挥作用的重要方式。此外,我们还发现THAP11/PCBP1可以抑制NF-κB转录活性,以及NF-κB下游基因IL-6启动子的活性,其机制与影响NF-κB的DNA结合活性无关。上述研究揭示了THAP11参与mRNA可变剪接的新功能,为认识THAP家族蛋白质新的功能提供了重要的线索,同时,加深了我们对THAP11调控肿瘤细胞恶性表型,作为一种新的候选抑癌基因的认识。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 THAP 家族蛋白质研究进展
• 1.1.1 THAP 结构域特征
• 1.1.2 果蝇和线虫THAP 家族蛋白质功能研究
• 1.1.3 人THAP 家族蛋白质功能研究进展
• 1.2 PCBP1 研究进展
• 1.2.1 PCBP1 结构特征
• 1.2.2 PCBP1 生物学功能
• 1.2.2.1 在转录水平上参与基因表达调控
• 1.2.2.2 参与mRNA 加工
• 1.2.2.3 稳定mRNA
• 1.2.2.4 在翻译水平上参与基因表达调控
• 1.3 对本论文的研究启示
• 第二章 THAP11与PCBP1相互作用区域的确定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌株和细胞株
• 2.1.1.2 质粒载体
• 2.1.1.3 引物
• 2.1.1.4 主要试剂
• 2.1.1.5 细菌培养基配制
• 2.1.1.6 细胞培养相关溶液配制
• 2.1.1.7 Western-blot 相关试剂
• 2.1.1.8 细胞总蛋白提取相关溶液
• 2.1.1.9 主要仪器
• 2.1.2 研究方法
• 2.1.2.1 THAP11 与PCBP1 缺失体的构建
• 2.1.2.2 回收、酶切
• 2.1.2.3 连接
• 2.1.2.4 转化
• 2.1.2.5 菌落PCR
• 2.1.2.6 质粒提取
• 2.1.2.7 细胞转染（Vigorous 公司）
• 2.1.2.8 细胞总蛋白提取
• 2.1.2.9 免疫共沉淀（co-immuno precipitatition ,Co-IP）
• 2.1.2.10 Western Blot
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 THAP11 及PCBP1 缺失体构建
• 2.2.2 THAP11/PCBP1 相互作用结构区域的确定
• 2.3 讨论
• 第三章 THAP11/PCBP1相互作用抑制CD44mRNA可变剪接
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 细胞和质粒
• 3.1.1.2 实验仪器
• 3.1.1.3 其他材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 荧光素酶报道基因检测
• 3.1.2.2 RNA 的提取
• 3.1.2.3 RT-PCR
• 3.1.2.4 荧光定量PCR 技术
• 3.1.2.5 细胞侵袭实验
• 3.1.2.6 RNAi 技术
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 THAP11/PCBP1 可以抑制细胞内源CD44v 的剪接水平
• 3.2.2 THAP11/PCBP1 下调CD44 v5 inclusion
• 3.2.3 THAP11 的外显子剪接特异性依赖于PCBP1
• 3.2.4 THAP11/PCBP1 下调Ras 对CD44 v5 inclusion 的激活
• 3.2.5 THAP11 可以抑制肿瘤细胞侵袭
• 3.2.6 THAP11 与CD44v6 表达相关性
• 3.3 讨论与分析
• 第四章 THAP11/PCBP1可以抑制NF-κB的转录活性
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay 凝胶迁移实验）
• 4.1.2.1 核蛋白的提取
• 4.1.2.2 EMSA 胶的配制
• 4.1.2.3 探针标记
• 4.1.2.4 探针与核蛋白结合
• 4.1.2.5 电泳分析
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 THAP11/PCBP1 抑制NF-κB 的转录活性
• 4.2.2 THAP11/PCBP1 选择性抑制NF-κB 下游基因IL-6 启动子的活性
• 4.2.3 THAP11/PCBP1 对NF-κB 的DNA 结合活性无影响
• 4.2.4 THAP11/PCBP1 可能通过不同的途径来抑制NF-κB 的转录活性
• 4.3 分析与讨论
• 第五章 研究总结与展望
• 5.1 研究结论
• 5.2 研究展望
• 参考文献
• 参加科研情况说明
• 致谢
• 附录一 引物序列、名称
• 附录二 英文缩略语