冬虫夏草无性型原生质体制备及种群遗传多样性研究

论文摘要

冬虫夏草是我国传统的、珍贵的中草药。目前，野生冬虫夏草产量急剧下降，而价格飞涨。为改变现状，人工培育冬虫夏草成为研究热点。了解冬虫夏草菌种的遗传多样性以及开展原生质体融合（Protoplast fusion）育种，将为实现上述目标提供研究基础和前提。本文应用不同的分离方法以及分离不同部位的组织获得了数十株冬虫夏草无性型中国被毛孢菌株，研究其原生质体制备的最佳工艺；同时，采用ISSR分子技术和交配型基因mat1-2-1获得了冬虫夏草种内的相关遗传多样性信息。通过研究获得以下结果。以冬虫夏草无性型中国被毛孢为原材料，通过液体培养获得菌丝体，经酶解处理后在不同条件下获得原生质体，以研究酶的种类及浓度、渗透压稳定种类及浓度、酶液pH值以及酶解时间的不同，对中国被毛孢原生质体制备的影响。结果显示中国被毛孢菌株原生质体的最佳制备条件为：使用浓度配比分别为4mg/ml和3mg/ml的Yatalase和Glucanex酶，在1.0MKCl作为渗透压稳定剂，酶液pH值为6时，酶解3h，所得的原生质体量最多。从60个引物中筛选出7个扩增条带清晰且多态性好的ISSR引物，并摸索合适的PCR反应条件，用于40株菌株的PCR反应。共得到62条带，其中多态性条带38条，多态性百分率仅为63.15%，遗传相似系数范围在0.781.00之间。进行UPGMA法聚类分析，得出：40株中国被毛孢菌株并没有完全按照不同的分离方法聚为3个类型。单子囊孢子分离法获得的菌株，区别于其它菌株而单独聚为一类，其它分离法获得的菌株混合聚类。可见，单子囊孢子菌株的ISSR指纹图谱与其它菌株有较明显差异。总的看来，同一地区的中国被毛孢各菌株间具有一定的遗传多样性，但遗传差异不是太大。参照Zhang等的交配型基因mat1-2-1的扩增引物，对本实验分离获得的40株菌株进行PCR特异扩增。取其中7个拼接好的MAT1-2-1区碱基序列，与来自GenBank数据在内的共11个样品构建系统发育树，发现本实验采自青海的7个供试菌株，连同GenBank中来自青海的菌株（FJ654176）共同组成了一大类群，其bootstrap值为96%；而GenBank中其他地区的菌株聚成另外的类群。mat1-2-1基因序列对于不同地区的菌株遗传多样性有一定的区分度，但未能有效的区分同一地区菌株间的遗传多样性。本实验分离得到的10株单子囊孢子菌株全部含有mat1-2-1基因，可以看出冬虫夏草的mat1-1:mat1-2不是按4:4进行分离，因此冬虫夏草可能不是异宗配型，极有可能是同宗配型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 冬虫夏草的研究概述
• 1.2 原生质体的研究概况
• 1.2.1 原生质体制备技术
• 1.2.2 虫生真菌原生质体制备技术的研究概况
• 1.2.3 原生质体技术的研究进展
• 1.3 遗传多样性的含义
• 1.4 遗传多样性的主要分子标记技术
• 1.5 交配型基因的研究进展
• 1.5.1 交配型基因在有性生殖方面的研究进展
• 1.5.2 交配型基因在系统发育及遗传变异性上的应用
• 2 引言
• 3 实验材料
• 3.1 供试菌株及其来源
• 3.2 主要培养基
• 3.3 主要仪器及试剂
• 3.4 所需溶液
• 4 实验方法
• 4.1 冬虫夏草菌株的分离
• 4.1.1 组织分离
• 4.1.2 子囊孢子弹射分离
• 4.1.3 单子囊孢子分离
• 4.2 菌种分离结果的鉴定
• 4.3 菌丝体的制备
• 4.3.1 酶解所需菌丝体的制备
• 4.3.2 DNA 提取所需菌丝体的制备
• 4.4 原生质体的制备
• 4.4.1 酶解体系的筛选
• 4.4.2 同种酶解体系中酶的不同浓度配比的筛选
• 4.4.3 酶解时间的筛选
• 4.4.4 酶液的 pH 的筛选
• 4.4.5 渗透压稳定剂的筛选
• 4.4.6 渗透压稳定剂浓度的筛选
• 4.5 DNA 的提取与纯化
• 4.6 DNA 浓度和质量的检测
• 4.6.1 凝胶电泳检测
• 4.6.2 紫外吸收检测
• 4.7 ISSR 用于种群遗传多样性的研究
• 4.7.1 ISSR引物的筛选
• 4.7.2 ISSR-PCR反应条件及程序
• 4.7.3 ISSR扩增产物的检测
• 4.7.4 ISSR电泳图谱统计与分析
• 4.8 交配型基因mat1-2-1用于种群遗传多样性的研究
• 4.8.1 mat1-2-1基因扩增引物
• 4.8.2 交配型基因mat1-2-1的扩增反应体系
• 4.8.3 扩增程序
• 4.8.4 测序
• 4.8.5 序列分析
• 5 结果与分析
• 5.1 菌种分离结果鉴定
• 5.1.1 组织分离与子囊弹射分离获得的菌株的鉴定
• 5.1.2 单子囊孢子分离菌株的鉴定-冬虫夏草微循环产孢
• 5.2 中国被毛孢分生孢子的液体培养
• 5.2.1 分生孢子液体培养的生长过程
• 5.2.2 分生孢子微循环产孢的方式
• 5.2.3 芽生孢子的形成方式
• 5.3 原生质体制备结果与分析
• 5.3.1 酶解体系的筛选
• 5.3.2 同种酶解体系中酶的不同浓度配比的筛选
• 5.3.3 酶解最佳时间的筛选
• 5.3.4 酶液的 pH 值的筛选
• 5.3.5 渗透压稳定剂的筛选
• 5.3.6 渗透压稳定剂浓度对原生质体制备的影响
• 5.3.7 原生质体产生方式观察
• 5.4 基因组DNA琼脂糖检测
• 5.5 ISSR用于种群遗传多样性的研究
• 5.5.1 ISSR扩增引物筛选结果
• 5.5.2 多态性分析
• 5.5.3 中国被毛孢菌株的ISSR聚类分析
• 5.6 交配型基因 mat1-2-1用于种群遗传多样性的研究
• 5.6.1 mat1-2-1基因的PCR扩增产物的电泳检测
• 5.6.2 mat1-2-1基因序列分析
• 5.6.3 交配型基因分析
• 6 讨论
• 6.1 冬虫夏草无性型菌株的鉴定及其生长过程的观察
• 6.2 菌龄对原生质体形成的影响
• 6.3 原生质体制备过程中的影响因素
• 6.3.1 酶的种类及其浓度配比
• 6.3.2 酶解时间
• 6.3.3 渗透压稳定剂的种类和浓度
• 6.4 ISSR分子技术
• 6.5 交配型基因mat1-2-1
• 6.6 ISSR 分子技术和交配型基因mat1-2-1 的比较
• 7 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文