论文摘要
第一部分“清活Ⅰ号”中药复方拮抗高糖导致血管内皮细胞氧化应激的作用及机制研究目的:血管并发症是糖尿病患者首要的致残与致死因素。内皮细胞功能紊乱在糖尿病血管并发症的发生发展中起重要作用。内皮细胞功能紊乱的根本机制在于内皮细胞线粒体活性氧簇（ROS）生成过多。前期研究已证实“清活Ⅰ号”中药复方（QHYH）体内可以降低2型糖尿病患者尿微量白蛋白排泄率,体外可以改善高浓度葡萄糖抑制的微血管内皮细胞的生长。本研究的目的是研究“清活Ⅰ号”拮抗高糖导致的氧化应激、保护内皮细胞的抗氧化机制。最近有研究表明,基因水平抑制解偶联蛋白2（UCP2）的表达可使内皮细胞ROS生成增加。因此,我们也研究了UCP2的表达变化是否与高糖导致小鼠脑微血管内皮细胞ROS生成增加有关,及UCP2是否参与QHYH的抗氧化应激作用。方法:bEnd.3细胞分别以正常浓度葡萄糖（NG,5.6mM）、高浓度葡萄糖（HG,25mM）、高糖加“清活Ⅰ号”（1:100稀释）培养。分别以H2DCF-DA和DAF-FMDA荧光探针检测内皮细胞ROS和一氧化氮（NO）的生成。UCP2 mRNA水平以实时荧光定量PCR检测。内皮源性一氧化氮合酶（eNOS）、Akt磷酸化水平及UCP2蛋白表达水平以westem blotting检测。以UCP2 siRNA进行RNA干扰抑制UCP2表达。结果:高糖增加bEnd.3细胞ROS生成,HG组ROS生成较NG组增加（142.27±11.44%vs.100.00±1.92%in NG group,P＜0.01）,同时使UCP2表达下调:高糖对UCP2 mRNA的抑制呈浓度依赖性,35mM时作用最强（69.90±4.84%,P＜0.01vs.NG group）,也呈时间依赖性,35mM葡萄糖作用48小时抑制作用最强（66.93±4.73%,P＜0.001vs.Oh group）。高浓度葡萄糖（35mM）抑制eNOSSer1177和Akt Ser473的磷酸化（45.49±2.51%and 76.71±4.00%,P＜0.01vs.NG group）抑制bEnd.3内皮细胞NO生成（53.83±3.98%,P＜0.01vs.NG group）.向高糖培养基中加入“清活Ⅰ号”,可逆转高糖导致的ROS生成增加（53.65±8.11%vs.142.27±11.44%in HG group,P＜0.001）、改善eNOS与Akt磷酸化（72.81±7.02%vs.45.49±2.51%in HG group,P＜0.05 and 120.98±1.20%vs.76.01±4.00%in HG group,P＜0.001）、NO生成（118.82±2.95%vs.53.83±3.98%in HG group,P＜0.001）、及UCP2蛋白表达（94.09±6.30%vs.53.83±3.98%in HG group,P＜0.001）.通过UCP2 siRNA抑制UCP2蛋白表达后,“清活Ⅰ号”拮抗高糖导致的氧化应激的作用减轻,不能改善高糖诱导的ROS生成及NO产生的下调。结论:“清活Ⅰ号”可通过抑制ROS生成,促进Akt、eNOS磷酸化和NO生成,拮抗高糖诱导的内皮细胞氧化应激。“清活Ⅰ号”保护内皮细胞的作用可能部分与其上调UCP2的表达有关。本研究结果提示“清活Ⅰ号”作为抗氧化剂治疗糖尿病血管并发症具有应用前景。第二部分“清活Ⅰ号”分离物对内皮细胞ROS生成的影响及机制探讨目的:前期研究已证实“清活Ⅰ号”中药复方具有抗氧化应激作用。本实验的目的是对“清活Ⅰ号”中药复方进行分离提纯取,检测其分离物抑制ROS生成的作用,明确“清活Ⅰ号”中药复方中参与氧化应激作用的化合物,并探讨所筛选化合物抗氧化应激的作用机理。解偶联蛋白2（UCP2）的表达可抑制内皮细胞ROS生成增加。高糖对内皮细胞UCP2的表达具有抑制作用。我们的研究也证实了“清活Ⅰ号”可改善高糖对UCP2的抑制作用,“清活Ⅰ号”的抗氧化应激作用可能与其改善UCP2表达有关。因此检测了“清活Ⅰ号”分离所得化合物对bEnd.3细胞UCP2 mRNA水平的影响。NADPH氧化酶是内皮细胞中ROS的重要来源。NADPH氧化酶由gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox等亚单位组成,因此本实验拟检测有效化合物对bEnd.3细胞NADPH氧化酶gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox基因表达的影响。方法:以溶剂萃取法对“清活Ⅰ号”水煎剂进行分离,获得3个部分。以大孔树脂法对清活Ⅰ号进行分离,获得5个部分。bEnd.3细胞分别以正常浓度葡萄糖（NG,5.6 mM）、高浓度葡萄糖（HG,25 mM）、高糖加不同浓度“清活Ⅰ号”分离提取物培养。以H2DCF-DA荧光探针检测bEnd.3细胞及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）ROS的生成。以MTT法检测“清活Ⅰ号”分离物对内皮细胞（bEnd.3细胞与HUVEC细胞）增殖的影响。以MCI硅胶层析、反复柱层析等方法对有效部分进一步分离提取。以实时荧光定量PCR检测“清活Ⅰ号”分离所得有效化合物对bEnd.3细胞UCP2、gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox mRNA水平的影响。结果:自“清活Ⅰ号”水煎剂中先后分离出28种粗提部分,通过对抑制高糖刺激ROS生成活性的筛选及进一步分离,共分离出12个化合物单体,其中9个为已知化合物,包括京尼平苷酸、京尼平苷、黄芪甲苷、葛根素、陈皮苷、西红花苷、川芎嗪、阿魏酸、绿原酸,文献均报道过其具有抗氧化活性。另三个化合物:E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1,结构暂未知,亦不明确其是否具有抗氧化活性。抑制高糖刺激ROS生成活性检测发现西红花苷、川芎嗪、阿魏酸、绿原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1在两种细胞模型（bEnd.3细胞与HUVEC细胞）上对高糖刺激ROS生成均有抑制作用,且对内皮细胞无明显毒性作用（E3-M15-2高浓度组除外）。高浓度葡萄糖可抑制bEnd.3细胞UCP2 mRNA水平,“清活Ⅰ号”及其分离物（西红花苷、川芎嗪、阿魏酸、绿原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1）可不同程度使UCP2 mRNA水平恢复。高浓度葡萄糖可使gp91phox、p22phox、p67phoxmRNA表达升高;“清活Ⅰ号”及川芎嗪可抑制高糖诱导的gp91phox、p22phox、p67phoxmRNA升高;西红花苷可抑制高糖上调的gp91phox与p67phoxmRNA水平:E3-M15-1可抑制高糖上调的gp91phox、p22phoxmRNA水平,阿魏酸、绿原酸仅可抑制高糖上调的p22phox mRNA水平。结论:“清活Ⅰ号”分离物西红花苷、川芎嗪、阿魏酸、绿原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1对高糖刺激ROS生成均有抑制作用,为“清活Ⅰ号”抗氧化应激作用的重要组成部分。“清活Ⅰ号”及其分离物（西红花苷、川芎嗪、阿魏酸、绿原酸、E1-H1-1）的抗氧化应激作用可能与其改善高糖对UCP2 mRNA的抑制及抑制高糖上调的NADPH氧化酶mRNA水平有关。
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