新城疫病毒地方分离株生物学特性的鉴定及疫苗候选株筛选的研究

论文摘要

本研究对自2000年以来从不同地区分离到的新城疫毒株中选取8株有代表性的毒株,经鸡胚终点稀释法克隆后,利用RT-PCR技术,成功地扩增出了8株NDV分离株F基因1629bp的核苷酸片段。利用DNAStar 6.0软件进行系统发育进化树的绘制,确定了基因型,并与参考毒株的核苷酸及相应氨基酸序列进行了比较。结果表明,其中6株分离毒株核苷酸同源率在97.4%～99.6%之间,与国内标准强毒株F48E9的核苷酸序列同源率为85.8%～89.3%;推导的氨基酸序列分析显示,这6株分离毒株氨基酸同源率在96.7%～99.3%之间;并且这6株分离毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的强毒株裂解位点的特点;从进化树上看这6株分离毒株都属于Ⅶ型。另外,2株分离毒株核苷酸同源率为99.5%;氨基酸同源率是98.7%;并且这2株分离毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112G-R-Q-G-R-L117,具有典型的弱毒株裂解位点的特点,和LaSota的核苷酸同源率较高,分别为98.8%和99.2%;这2株分离毒株都属于基因Ⅱ型。在以上生物学试验分析的基础上,将8株分离株及LaSota、I系、Clone30、F48E9共12株NDV,进行交叉血凝抑制试验和交叉病毒中和试验。结果表明,毒株之间存在一定的抗原性差异。综合8株分离株的基因型、生物学特性和交互免疫性,筛选出2株疫苗候选株,为HB38和F1。致病性试验表明,HB38的MDT为45.6h,ICPI为1.94,IVPI为2.98;F1的MDT为55.2h,ICPI为1.96,IVPI为2.79。这些指标都符合强毒株的标准。对HB38和F1应用RT-PCR技术成功地克隆了HN基因,利用DNAStar 6.0软件进行系统发育进化树的绘制,并与参考毒株的核苷酸及相应氨基酸序列进行了比较。分析表明,HB38和Guangxi/2002同属于一个进化分支,氨基酸同源率为99.7%;F1和YN-PA01同属于一个进化分支,氨基酸同源率为98.1%;而HB38、F1与国内标准强毒株F48E9氨基酸的同源率分别为89.7%和88.8%。交叉免疫保护试验表明,HB38和F1对3种不同毒株攻击均可提供较好的保护。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 NDV 的生物学特性
• 1.1.1 NDV 的结构及形态特性
• 1.1.2 血凝特性（Hemagglutinin，HA）
• 1.1.3 神经氨酸酶活性（Neuraminidase，NA）
• 1.1.4 细胞融合与溶血活性
• 1.1.5 抗肿瘤和抗衰老
• 1.1.6 NDV 抗原性
• 1.1.7 NDV 的复制
• 1.2 NDV 基因组结构及其功能
• 1.2.1 NDV 基因组结构
• 1.2.2 NDV 结构蛋白及功能
• 1.2.2.1 核衣壳蛋白（NP）
• 1.2.2.2 磷蛋白（P）
• 1.2.2.3 基质蛋白（M）
• 1.2.2.4 RNA 依赖性RNA 聚合酶（L）
• 1.2.2.5 血凝素-神经氨酸酶（HN）
• 1.2.2.6 融合蛋白（F）
• 1.3 NDV 致病性的分子基础
• 1.4 ND 的流行病学及分类
• 1.4.1 ND 的流行病学
• 1.4.2 ND 的一般分类
• 1.4.3 ND 流行病学与基因分型
• 1.4.3.1 利用单克隆抗体技术进行毒株的分型
• 1.4.3.2 利用 F 基因进行毒株的分型
• 1.5 ND 的免疫
• 1.5.1 细胞免疫
• 1.5.2 体液免疫
• 1.5.3 局部免疫
• 1.5.4 被动免疫
• 1.6 ND 检测与诊断技术
• 1.6.1 病毒的分离与鉴定
• 1.6.2 血清学检测技术
• 1.6.3 分子生物学诊断技术
• 1.7 ND 的防制
• 1.8 本试验研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 毒株
• 2.2 SPF 鸡和SPF 鸡胚
• 2.3 主要试剂和仪器
• 2.4 病毒的克隆纯化
• 2.5 NDV 分离株F 基因的克隆
• 2.5.1 引物设计与合成
• 2.5.2 病毒 RNA 提取、反转录及 PCR 扩增
• 2.5.3 RT-PCR 产物的回收
• 2.5.4 回收产物连接
• 2.5.5 DH5α感受态细胞的制备
• 2.5.6 连接产物转化
• 2.5.7 含目的基因质粒的扩增
• 2.5.8 重组质粒的提取与鉴定
• 2.5.8.1 重组质粒的提取
• 2.5.8.2 重组质粒的鉴定
• 2.5.9 序列测定及分析
• 2.6 分离株及 LASOTA、I 系、CLONE30、FE的交互免疫性的研究
• 2.6.1 抗原的制备及甲醛灭活对血凝性的影响
• 2.6.2 疫苗的制备
• 2.6.3 高免血清的制备
• 2.6.4 1%红细胞悬液的制备
• 2.6.5 各毒株相互之间交叉 HI 试验
• 2.6.6 各毒株相互之间交叉病毒中和试验
• 2.6.6.1 鸡胚原代成纤维细胞（CEF）的制备
• 50的测定'>2.6.6.2 各毒株 TCID₅₀的测定
• 50)的测定'>2.6.6.3 各毒株相互之间交叉病毒中和价(PD₅₀)的测定
• 2.7 NDV 疫苗候选株的生物学特性
• 2.7.1 鸡胚最小致死量的平均致死时间（MDT）的测定
• 2.7.2 1 日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定
• 2.7.3 6 周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）的测定
• 2.7.4 NDV 疫苗候选株 HN 基因的克隆
• 2.7.4.1 引物设计
• 2.7.4.2 病毒 RNA 提取、反转录及 PCR 扩增
• 2.7.4.3 RT-PCR 产物的回收、连接、转化及重组质粒的提取
• 2.7.4.4 重组质粒的鉴定
• 2.7.4.5 序列测定及分析
• 2.8 NDV 疫苗候选株的免疫保护试验的研究
• 3 结果
• 3.1 F 基因的RT-PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.3 分离株 F 基因片段序列及同源性比较结果
• 3.4 甲醛灭活对血凝性的影响结果
• 3.5 各毒株相互之间交叉HI 价测定结果
• 3.6 各毒株相互之间的 HI 相关系数 R 的计算结果
• 50的测定值结果'>3.7 各毒株 TCID₅₀的测定值结果
• 50)的测定结果'>3.8 各毒株相互之间交叉病毒中和价(PD₅₀)的测定结果
• 50相关系数 R 的计算结果'>3.9 各毒株相互之间的PD₅₀相关系数 R 的计算结果
• 3.10 NDV 疫苗候选株的 MDT、ICPI 和IVPI 测定结果
• 3.11 疫苗候选株 H838 和 F1 的 HN 基因的 RT-PCR 扩增结果
• 3.12 疫苗候选株 H838 和 F1 的 HN 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.13 疫苗候选株 H838 和 F1 的 HN 基因片段序列及同源性比较结果
• 3.14 NDV 疫苗候选株的免疫保护试验结果
• 4 讨论
• 4.1 F 基因生物学特性
• 4.2 交互免疫性的研究
• 4.3 疫苗候选株的生物学特性
• 4.4 疫苗候选株的应用前景
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介