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载Survivin siRNA的壳聚糖及水溶性壳聚糖纳米粒的制备、鉴定及生物活性研究

2020-12-16阅读(140)

载Survivin siRNA的壳聚糖及水溶性壳聚糖纳米粒的制备、鉴定及生物活性研究

论文摘要

Survivin是目前发现的一种只高表达于人癌症细胞而不表达于周围正常组织的凋亡抑制蛋白,siRNA通过RNA干扰使Survivin基因沉默就能使癌细胞恢复凋亡,从而达到治疗癌症的目的。壳聚糖纳米粒作为非病毒基因递送载体可以防止siRNA被降解,并且生物相容性良好、低毒、低免疫原性。但是壳聚糖水溶性较差的问题也引起了人们的广泛思考。为了探索水溶性壳聚糖作为Survivin siRNA载体的可行性以及抑制基因表达的效果,本文对制备水溶性壳聚糖的条件进行了优化,将优化的改性壳聚糖进行红外光谱和X射线衍射分析;并对壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖纳米粒用复凝聚法进行制备,琼脂糖凝胶电泳分析纳米粒与DNA结合能力,比色法检测其包封率,透射电镜检测纳米粒的形态和粒径;用脂质体作为阳性对照,纳米粒体外转染Hep-2喉癌细胞观察其抑制癌细胞Survivin基因表达的效果。结果表明,乙酸1.0 ml,乙酸酐1.0ml,乙醇25ml,吐温80 1.0ml,吡啶6ml,搅拌1h时,单因素法控制脱乙酰度（D.D.）得到的改性壳聚糖水溶性最好（D.D.=50.73%）,红外光谱分析发现顺利引入了乙酰基,降低了壳聚糖的脱乙酰度,X射线衍射发现壳聚糖的晶型受到破坏,结构规整性和结晶性都有所下降,从而具有水溶性。由琼脂糖凝胶电泳结果可知,siRNA与壳聚糖及水溶性壳聚糖均有效结合。壳聚糖纳米粒包封率为92.8%,水溶性壳聚糖纳米粒包封率为88%92%。由透射电镜可知CS-TPP/siRNA纳米粒粒径50100nm,改性CS-TPP/siRNA纳米粒粒径100nm左右,圆形颗粒。这就为进一步进行体外和体内转染奠定了基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 绪论
  • 1.1 国内外研究现状
  • 1.1.1 癌症的基因治疗现状
  • 1.1.2 纳米颗粒作为基因递送系统
  • 1.1.3 壳聚糖及其纳米粒的制备
  • 1.1.4 水溶性壳聚糖的制备
  • 1.2 本文研究的目的、意义及内容
  • 2 siRNA/壳聚糖纳米粒的制备和表征
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验仪器和试剂
  • 2.2.1 实验仪器
  • 2.2.2 实验试剂
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 质粒的扩增
  • 2.3.2 质粒基因的小量提取
  • 2.3.3 质粒DNA 的鉴定及浓度、纯度测定
  • 2.3.4 壳聚糖空白纳米粒及壳聚糖/Survivin siRNA纳米粒的制备
  • 2.3.5 壳聚糖与质粒的结合实验
  • 2.3.6 纳米粒包封率的测定
  • 2.3.7 纳米粒的形态
  • 2.4 实验结果和讨论
  • 2.4.1 质粒纯度影响因素
  • 2.4.2 质粒DNA 的鉴定及浓度、纯度测定
  • 2.4.3 壳聚糖与质粒的结合实验
  • 2.4.4 纳米粒包封率的测定
  • 2.4.5 纳米粒的形态
  • 2.5 本章小结
  • 3 水溶性壳聚糖的制备和表征
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验仪器和试剂
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 壳聚糖的改性研究
  • 3.3.2 单因素实验设计
  • 3.3.3 改性壳聚糖化学结构表征
  • 3.4 实验结果和讨论
  • 3.4.1 乙酸变化量对D.D.的影响
  • 3.4.2 乙酸酐变化量对D.D.的影响
  • 3.4.3 乙醇变化量对D.D.的影响
  • 3.4.4 吐温80变化量对D.D.的影响
  • 3.4.5 吡啶变化量对D.D.的影响
  • 3.4.6 搅拌时间变化量对D.D.的影响
  • 3.4.7 水溶性壳聚糖红外光谱结构表征
  • 3.4.8 水溶性壳聚糖X 射线衍射结构表征
  • 3.4.9 均相条件的控制
  • 3.4.10 脱乙酰度的测定
  • 3.4.11 壳聚糖脱乙酰度的影响因素
  • 3.5 本章小结
  • 4 siRNA/水溶性壳聚糖纳米粒的制备和表征
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验仪器和试剂
  • 4.2.1 实验仪器
  • 4.2.2 试剂
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 质粒的小量提取
  • 4.3.2 针对Survivin siRNA/壳聚糖及改性壳聚糖纳米粒的制备
  • 4.3.3 壳聚糖及改性壳聚糖与siRNA结合实验
  • 4.3.4 纳米粒的包封率测定
  • 4.3.5 纳米粒形态检测
  • 4.4 实验结果和讨论
  • 4.4.1 壳聚糖及改性壳聚糖与siRNA的结合情况分析
  • 4.4.2 NP 的包封率测定结果
  • 4.4.3 纳米粒形态检测
  • 4.5 本章小结
  • 5 Survivin siRNA/改性壳聚糖纳米粒的体外转染研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验仪器和材料
  • 5.2.1 实验仪器
  • 5.2.2 实验材料
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 细胞复苏
  • 5.3.2 细胞传代
  • 5.3.3 细胞计数
  • 5.3.4 细胞冻存
  • 5.3.5 细胞铺板
  • 5.3.6 脂质体-pDNA 转染复合物的制备
  • 5.3.7 载基因壳聚糖纳米粒的体外基因转染
  • 5.4 实验结果与讨论
  • 5.4.1 细胞培养
  • 5.4.2 转染实验
  • 5.5 小结
  • 6 结论及展望
  • 6.1 主要结论
  • 6.2 后续研究工作的展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

    • 相关论文文献

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