重组大肠杆菌表达荧光素酶的研究

论文摘要

以萤火虫荧光素酶植物表达报告载体pXP2为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶（LUC）的基因（luc）,构建了诱导型表达载体pQE30-luc。转化其宿主菌E. coli M15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc。SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子量为60 kD,表达量占全菌胞内可溶性蛋白的50.9 %。利用表达载体pQE30上的His·Tag标记选用Ni柱纯化重组荧光素酶（LUC）,纯化后比酶活达到1.43×109 RFU/ mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,酶反应的最适pH为7.5,热稳定性良好,对光和盐浓度很敏感,金属离子Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、NH4+在一定程度上可以促进该酶酶活,其中Mg2+促进作用最为明显。考察了不同的酶保存液对重组荧光素酶稳定性的影响。EDTA、BSA和DTT可以提高酶的稳定性,而TritonX-100在低浓度范围内可以保护荧光素酶,但浓度继续升高会降低荧光素酶的稳定性。单因素试验中,EDTA浓度为1.0 mmol/L,BSA为0.2%,DTT为4.0 mmol/L,TritonX-100为0.2%最有利于酶的稳定性。正交试验结果显示:DTT为4.0 mmol/L,EDTA为1.5 mmol/L,TritonX-100为0.1%,BSA为0.2%最有利于荧光素酶的保存,30 D后还可保存89.18%的酶活。通过对发酵条件单因素的优化,得知重组萤火虫荧光素酶的最佳发酵条件是:初始pH7.0,装液量20%,2%的接种量,终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,添加1030 mmol/L的Mg2+,摇床转速200 r/min,37℃诱导3.5 h。在此条件下,萤火虫荧光素酶的表达量最高。正交试验结果表明:初始pH 7.0,添加40 mmol/L Mg2+,接种量2%,装液量20%时酶表达量最高,比酶活达1.63×108 RFU/mg。由重组菌在5 L罐上的发酵曲线可以得知:在5 L发酵罐上的发酵过程与摇瓶中发酵过程曲线基本吻合,LUC的最高酶活达到了2.01×108 RFU/mg。由此可以依据此条件进行放大培养。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 荧光素酶简介
• 1.2 荧光素酶的种类
• 1.3 荧光素酶的结构
• 1.3.1 细菌荧光素酶的结构
• 1.3.2 萤火虫荧光素酶的结构
• 1.4 荧光素酶催化发光的原理
• 1.4.1 细菌荧光素酶
• 1.4.2 萤火虫荧光素酶
• 1.5 荧光素
• 1.5.1 荧光素种类
• 1.5.2 荧光素的结构、性质与合成
• 1.6 荧光素酶的制备与生产
• 1.7 荧光素酶的应用
• 1.7.1 作为报告基因检测系统
• 1.7.2 在生命科学研究中的应用
• 1.7.3 研究蛋白质之间作用
• 1.7.4 用于RNA 干扰研究
• 1.7.5 在细胞分析中的应用
• 1.7.6 微生物检测
• 1.7.7 在医学上的应用
• 1.8 本论文的研究内容
• 第二章 荧光素酶编码基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和载体
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 培养基及培养条件
• 2.2.4 工具酶及其他试剂
• 2.2.5 萤火虫荧光素酶基因的克隆
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.7 质粒DNA 的提取
• 2.2.8 大肠杆菌表达载体的构建和编码荧光素酶基因的诱导表达
• 2.2.9 重组菌全细胞蛋白SDS-PAGE 分析
• 2.2.10 荧光素酶活性检测
• 2.2.11 蛋白质含量测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 luc DNA 的克隆及分析
• 2.3.2 含萤火虫荧光素酶基因luc 的重组载体pQE30-luc 的构建
• 2.3.3 luc 基因在E. coli M15 中表达
• 2.3.4 重组大肠杆菌全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3.5 萤火虫荧光素酶酶活力测定
• 2.3.6 重组大肠杆菌质粒稳定性分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 萤火虫荧光素酶的纯化及酶学性质的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 培养基及培养条件
• 3.2.4 萤火虫荧光素酶的纯化
• 3.2.5 萤火虫荧光素酶酶活力测定
• 3.2.6 蛋白质含量测定
• 3.2.7 荧光素酶的酶学性质研究
• 3.2.8 不同的酶保存液对荧光素酶酶活稳定性的影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 luc 基因在E. coli M15 中表达与重组蛋白的纯化
• 3.3.2 萤火虫荧光素酶的酶学性质
• 3.3.3 不同的酶保存液对荧光素酶酶活稳定性的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 M15/pQE30-luc 产 LUC 发酵条件的优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 菌株
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 荧光素酶活性检测
• 4.2.6 蛋白质含量测定
• 4.2.7 发酵条件的优化及正交实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 初始pH 的影响
• 4.3.2 不同IPTG 浓度的影响
• 4.3.3 IPTG 诱导时间的影响
• 2+的影响'>4.3.4 不同浓度的Mg²⁺的影响
• 4.3.5 不同接种量的影响
• 4.3.6 不同装液量的影响
• 4.3.7 不同转速的影响
• 4.3.8 正交实验结果
• 4.3.9 5L 发酵罐上重组菌的发酵特征
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文