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鸡Nramp1基因的遗传变异、表达以及与部分免疫性状的关联分析

2020-12-12阅读(716)

鸡Nramp1基因的遗传变异、表达以及与部分免疫性状的关联分析

论文摘要

Nrampl （natural resistance associated macrophage protein）基因,即天然抗性相关的巨噬蛋白基因,该基因与伤寒沙门氏菌、利什曼菌、卡介苗分枝杆菌等多种细胞内感染病原体的易感性和抗性有关。本实验以15个鸡品种为实验动物,利用PCR-SSCP技术对15个鸡品种Nramp1基因第9外显子进行多态性分析和比较。以如皋鸡、漳州斗鸡和隐性白羽鸡为研究对象,测定部分免疫指标,并与SSCP结果进行关联分析；同时采用荧光定量PCR技术分析不同基因型个体的Nramp1基因在如皋鸡中的时空表达规律,主要研究结果如下：1.在白耳鸡、大骨鸡、茶花鸡、固始鸡、北京油鸡、泰和乌骨鸡、藏鸡、如皋鸡、漳州斗鸡、文昌鸡、泰原鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、隐形白羽鸡、安卡鸡15个鸡种中对Nramp1基因第九外显子进行单核苷酸多态性分析,结果发现5个突变位点：C242A、C315G、C357T、G419T、C427T。15个鸡品种（除鹿苑鸡）的杂合度都在0.382-0.500之间,多态信息含量在0.35左右。2.以如皋鸡、漳州斗鸡和隐性白羽鸡为研究对象,检测了3个品种的部分免疫性状。结果显示：（1）如皋鸡法氏囊指数在2周龄时最大,胸腺指数在8周龄时最大,脾脏指数在6周龄时最大；（2）如皋鸡淋巴细胞转化率随日龄的增加而增加；（3）如皋鸡IgG和IgM含量在0周龄时最大,随后逐渐的变小,到最后逐渐达到平稳。（4）不同品种免疫性状相比,如皋鸡的H/L比值要显著低于隐性白羽鸡和漳州斗鸡（P<0.05）,而如皋鸡淋巴细胞转化率要显著高于隐性白羽鸡和漳州斗鸡（P<0.05）,漳州斗鸡的IgG和IgM含量显著高于如皋鸡和隐性白羽鸡（P<0.05）,同时如皋鸡也显著高于隐性白羽鸡（P<0.05）。结果表明,中国地方鸡品种的综合免疫性能要优于外来引进品种。3.不同基因型与免疫性状相关分析表明：如皋鸡不同基因型的大部分免疫指标存在显著差异,AA基因型的H/L值显著低于AB基因型和BB基因型（P<0.05）；AB基因型和BB基因型间也存在显著差异（P<0.05）。AA基因型的淋巴细胞转化率,IgM含量和IgG含量的均值都高于AB基因型和BB基因型,且差异显著（P<0.05）,AB基因型与BB基因型之间差异不显著（P>0.05）,但AB基因型的均值要高于BB基因型。在漳州斗鸡和隐性白羽鸡中也有同样的趋势。这说明AA基因型个体在3个群体中都表现出了较好的抗逆性和抗应激的能力。4.如皋鸡不同基因型与经济性状相关分析结果表明：AA基因型个体的腹脂重高于BB基因型,且差异显著（P<0.05）。除此之外不同基因型的其他经济性状相比,差异都不显著（P>0.05）。说明不同基因型与经济性状之间无明显负相关,进一步表明AA基因型可以作为候选抗病基因型。5.Nramp1基因在鸡11个组织中都表达,胸腺、心脏和肝脏中呈高度表达,胸腺和法氏囊的表达规律基本一致。胸腺的表达量显著高于法氏囊（P<0.05）。心脏和肝脏在0周龄时表达量较高,而法氏囊和胸腺在6周龄表达量较高；不同基因型与表达量相关分析表明Nramp1基因不同基因型个体在相同组织中表达水平不存在显著差异（P>0.05）。但是AA基因型的均值在3种基因中是最高的,这可能和AA基因型的综合免疫性能较优有关。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 抗病育种概述
  • 1.1 抗病育种的遗传基础
  • 1.2 抗性基因
  • 1.3 表型选择
  • 1.4 标记辅助选择
  • 1.5 转基因与抗病育种
  • 1.6 候选基因法与抗病育种
  • 2 免疫概述
  • 2.1 免疫球蛋白
  • 3 免疫指标测定方法
  • 3.1 免疫器官指数检测方法
  • 3.2 H/L值的测定
  • 3.3 MTT法
  • 3.4 ELISA法
  • 4 Nramp1基因的研究进展
  • 4.1 Nramp1基因的序列结构
  • 4.2 Nramp1的可能功能与作用机制
  • 4.3 Nramp1基因的研究现状
  • 5 PCR-SSCP技术
  • 6 荧光定量PCR
  • 6.1 荧光定量PCR原理
  • 6.2 荧光化学
  • 6.3 荧光定量PCR的应用
  • 7 本研究的目的和意义
  • 第二章 鸡Nramp1基因PCR-SSCP多态性研究
  • 1 实验材料与试剂
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 采样方法和测定时间
  • 1.3 主要仪器设备
  • 1.4 主要试剂
  • 1.5 常规溶液及试剂配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 实验引物
  • 2.2 禽血DNA的提取
  • 2.3 DNA浓度和纯度的检测
  • 2.4 稀释引物
  • 2.5 PCR最佳反应条件的确定
  • 2.6 PCR扩增产物检测
  • 2.7 PCR-SSCP分析
  • 3 统计方法
  • 3.1 基因频率和基因型频率的计算
  • 3.2 15个品种的Hardy-Weinberg平衡检验
  • 3.3 群体遗传参数及系统树的绘制
  • 3.4 杂合度（Heterozygosity,H）,即基因多样性
  • 3.5 多态信息含量（Polymrphism Information Content,PIC）
  • 3.6 有效等位基因数（Effective Number of Alleles,Ne）
  • 4 结果
  • 4.1 鸡基因组DNA的提取
  • 4.2 PCR产物的扩增结果
  • 4.3 PCR-SSCP结果
  • 4.4 不同品种基因型分布
  • 4.5 不同品种的基因频率的差异比较
  • 4.6 Nramp1基因的群体遗传变异分析
  • 5 讨论
  • 第三章 免疫性状以及生产性状的测定
  • 1 实验材料与试剂
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 采样方法和测定时间
  • 1.3 主要仪器设备
  • 1.4 主要试剂
  • 1.5 常规试剂配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 免疫指数的测定
  • 2.2 H/L比值的测定
  • 2.3 淋巴细胞转化率的测定
  • 2.4 IgG和IgM含量的测定
  • 2.5 12周龄如皋鸡生产性能的测定
  • 2.6 统计模型
  • 3 结果
  • 3.1 如皋鸡不同周龄之间免疫指标的比较
  • 3.2 如皋鸡免疫指标不同周龄间的比较
  • 3.3 不同鸡品种的免疫性状的比较
  • 3.4 不同基因型与免疫指数之间的相关分析
  • 3.5 不同基因型免疫性状的比较
  • 3.6 如皋鸡不同基因型经济性状的比较
  • 4 讨论
  • 4.1 如皋鸡免疫指数的变化规律
  • 4.2 如皋鸡淋巴细胞转化率的变化规律
  • 4.3 如皋鸡免疫球蛋白的变化规律
  • 4.4 不同品种之间免疫性状的比较
  • 4.5 Nramp1基因多态性与免疫指标和经济性状的相关分析
  • 第四章 Nramp1基因的动态表达规律
  • 1 试验材料
  • 2 实验试剂与材料
  • 2.1 主要仪器设备
  • 2.2 主要试剂
  • 2.3 实验引物
  • 3 实验方法
  • 3.1 提取RNA前的准备工作
  • 3.2 总RNA的提取
  • 3.3 RNA质量和浓度测
  • 3.4 RT-PCR扩增
  • 3.5 实时荧光定量PCR检测
  • 3.6 统计方法
  • 4 结果
  • 4.1 如皋鸡总RNA的提取
  • 4.2 Nramp1基因扩增产物的特异性
  • 4.3 如皋鸡11个组织Nramp1基因表达量的研究
  • 4.4 Nramp1在如皋鸡中的表达规律
  • 4.5 Nramp1基因在如皋鸡的不同性别,不同周龄免疫器官中的差异表达
  • 4.6 Nramp1基因在12周龄的不同品种中的差异表达
  • 4.7 Nramp1基因在不同基因型个体的免疫器官中的表达规律
  • 5 讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录

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