五个不同地区牦牛部分生产性能候选基因多态性的研究

论文摘要

本研究利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术,对新疆巴州牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海环湖牦牛四个不同类群及培育品种大通牦牛PRL、PRLR、GH、GHR、IGF-Ⅰ五个候选基因遗传多态性进行了测定,分析了等位基因频率、基因型频率、多态信息含量、杂合度和有效等位基因数等指标,并运用最小二乘法分析了所发现的基因多态位点与牦牛体尺、体重等生长发育性状的关系,初步探讨了PRL、PRLR、GH、GHR、IGF-Ⅰ基因作为影响生长发育性状候选基因的可能性,取得了如下研究结果:1.利用PCR-SSCP技术对类胰岛素生长因子-Ⅰ基因（IGF-Ⅰ）多态性研究表明:（1）首次在牦牛IGF-Ⅰ基因的第1内含子发现PCR-SSCP多态,IGF-Ⅰ基因第1内含子的PCR-SSCP多态性检测结果表明,该多态位点由一对等位基因A、B控制,序列比对发现在67bp处单碱基C的缺失,造成了该多态位点的出现。等位基因A（B）在大通牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海环湖牦牛、新疆巴州牦牛群体中的基因频率分别为:0.9028（0.0972）、0.9234（0.0766）、0.8485（0.1515）、0.7929（0.2071）、0.9200（0.0800）,等位基因A为五个群体中的优势等位基因。（2）IGF-Ⅰ基因第5外显子的PCR-SSCP分析结果表明,品种间基因型分布存在显著差异。在大通牦牛中检测到了从、BB和AB三种基因型,而在其它群体中只发现AA型,呈单态型,达到了纯合状态。经克隆测序表明:该位点的多态是由于在202bp处一个T→C的突变,导致等位基因A突变成等位基因B。（3）对IGF-Ⅰ基因上2个多态位点不同基因型与大通牦牛6月龄生长发育性状指标进行显著性检验,结果表明,IGF-Ⅰ基因第1内含子AA基因型的体重、体斜长显著高于AB、BB基因型（P＜0.05）。（4）IGF-Ⅰ基因的二个多态位点基因型与大通牦牛早期发育的分析表明,18月龄IGF-Ⅰ第5外显子位点AA基因型的个体体高最小二乘均值（91.43cm）,与BB型（80.00cm）差异显著（P＜0.05）。在牦牛的早期选育中,AA型个体可以作为选留的对象。（5）六月龄大通牦牛群体体尺指标与甘南牦牛和天祝白牦牛群体比较可以看出不论公牛群还是母牛群,大通牦牛的平均体重显著大于甘南牦牛和天祝牦牛群体平均体重（P＜0.05）:大通牦牛的平均体斜长显著比甘南牦牛和天祝白牦牛长（P＜0.05）,而胸围相比大通牦牛略高于其它两个群体但差异不显著（P＞0.05）。在这些体尺指标上,大通牦牛表现出明显的优势。2.利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对GH基因、GHR基因多态性进行了研究,结果表明:（1）GH基因第3外显子在183bp处发生T-C突变,该多态位点由一对等位基因A、B控制,其中A为优势等位基因,AA为优势基因型。五个群体的哈代—温伯格平衡检验结果显示,青海大通牦牛、青海环湖牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛处于非平衡状态。运用最小二乘法对三个牦牛群体进行分析发现GH基因第3外显子对体重有显著影响（P＜0.05）,其中,最小二乘法得出的均值,AA型最大,AB型次之,最小的为BB型。另外,GH基因第3外显子对体长也有显著影响（P＜0.05）,其中AA型体长最长,AB型次之,BB型体长最短。GH基因第3外显子对体高、胸围、管围无显著性影响（P＞0.05）。（2）GH基因第5外显子在64bp处发生A-C的突变。GH基因第5外显子位点上,A1为优势等位基因,A1A1为优势等位基因型。五个品种进行的哈代—温伯格平衡检验结果显示,甘南牦牛处于非平衡状态;运用最小二乘法对五个牦牛品种进行分析发现第5外显子对生长发育指标没有显著影响（P＞0.05）。（3）经过PCR-SSCP分析,GH基因保守区位点呈单态性,没有发现多态性信息。（4）经过PCR-RFLP分析,特异性GH-ⅠR引物对牦牛基因进行PCR扩增,得到一条长约1244bp的产物,用限制性内切酶AvaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、PstⅠ、SmaⅠ进行酶切,AvaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、PstⅠ均具有预期的酶切位点,没有发现多态性,而SmaⅠ不具有预期的酶切位点,经测序比较,发现在878位点处的SmaⅠ酶切位点“CCC|GGG”丢失。特异性GH-2R引物对牦牛基因组进行PCR扩增,得到长度约为1037bp的DNA片段。采用限制性内切酶HinfⅠ、SmaⅠ、PstⅠ对该PCR产物进行单酶酶切,结果发现HinfⅠ、SmaⅠ、PstⅠ均具有酶切位点,且电泳检测结果与预期相一致,不具有限制性片段长度多态性。而GH-2R在限制性内切酶HaeⅢ的切点中,电泳检测结果与预期不一致,经测序比较,发现在75位点处的酶切位点“CC|GG”丢失。3.利用PCR-SSCP技术对PRL、PRLR基因多态性进行了研究,结果表明:催乳素受体基因的第2外显子、第3外显子在大通牦牛、甘南牦牛、天祝白牦牛、青海环湖牦牛、新疆巴州牦牛5个品种中检测到了AA、AB和BB基因型,而且在PRLR-exon2中A等位基因为5个牦牛群体的优势等位基因,具有较高的基因频率;在PRLR-exon3中,B等位基因较A基因占优势。PRLR-exon2在大通牦牛、新疆牦牛、天祝白牦牛、青海环湖牦牛、甘南牦牛A基因频率都超过了0.500,分别为0.520、0.560、0.600、0.580和0.640。基因多态信息表现为中度多态。测序表明催乳素受体基因第二外显子在174bp处的突变,为A→G,表现多态性。PRLR-exon3,在大通牦牛、天祝白牦牛、甘南牦牛、青海环湖牦牛、新疆牦牛五个群体中都检测出AA、BB、AB三个基因型,而且B等位基因为优势等位基因。PRLR-exon3的PCR-SSCP结果及测序结果分析显示该位点的98bp处多态为C→G取代造成。等位基因A（B）在大通牦牛,天祝白牦牛、甘南牦牛、青环湖原牦牛、新疆巴州牦牛的基因频率分别为:0.460（0.540）、0.420（0.580）、0.500（0.500）、0.460（0.540）、0.450（0.550）。在PRLR-exon3中,除了在天祝白牦牛中表现为高度多态,其余牦牛品种多为中度多态,遗传力较高,作为遗传杂交可能有较强优势。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 催乳素及其受体
• 1.1 PRL的结构特点
• 1.2 PRLR的结构特点
• 1.3 PRL的分泌及其调节
• 1.3.1 PRL的分泌
• 1.3.2 PRL分泌的调节
• 1.4 PRL信号转导途径
• 1.5 PRL的主要生物学功能
• 1.5.1 对乳腺与泌乳的作用
• 1.5.2 对性腺的作用
• 1.5.3 对免疫功能的调节作用
• 1.5.4 参与应激反应
• 1.5.5 PRL对胎儿生长发育的影响
• 1.5.6 EM患者PRL分泌功能及其与LPD和不育的关系
• 1.5.7 其他作用
• 2 类胰岛素生长因子系统
• 2.1 类胰岛素生长因子（IGF）
• 2.1.1 IGF-Ⅰ分子结构
• 2.1.2 IGF生物合成部位
• 2.1.3 IGF分泌调节
• 2.2 IGF结合蛋白（IGF-BP）
• 2.2.1 IGFBPs结构
• 2.2.2 IGFBPs对IGFs活性的调节
• 2.2.3 IGFBPs基因的表达调控
• 2.3 IGFs的主要生物学功能
• 2.3.1 IGFs在胚胎发育中的重要作用
• 2.3.2 IGF-Ⅰ的促生长作用
• 2.3.3 IGF-Ⅰ与免疫
• 2.3.4 IGF-Ⅰ与肿瘤
• 2.3.5 IGF-Ⅰ对新生动物小肠发育的影响
• 2.3.6 IGF-Ⅰ对泌乳的影响
• 2.3.7 IGF-Ⅰ对生殖系统的影响
• 2.3.8 IGF-Ⅰ在畜牧业中的应用前景
• 3 生长激素及其受体
• 3.1 GH的结构特点
• 3.2 GH信号转导途径
• 3.2.1 通过GH-受体的信号传递
• 3.2.2 生长激素结合蛋白（GHBP）
• 3.3 GH的主要生物学功能
• 4 分子标记方法概述
• 4.1 基因多样性及其研究意义
• 4.2 基因多样性研究中的分子方法
• 4.2.1 限制性酶切片段长度多态性（RFLP）分析
• 4.2.2 扩增片段长度多态性（AFLP）分析
• 4.2.3 随机扩增多态DNA（RAPD）分析
• 4.2.4 单位点微卫星多态性分析
• 4.2.5 序列标记微卫星（STMs）
• 4.2.6 DNA单链构象多态性（PCR-SSCP）分析
• 5 候选基因的研究现状
• 5.1 PRL基因结构及多态性研究进展
• 5.1.1 PRL基因结构
• 5.1.2 PRL基因的表达
• 5.1.3 PRL基因多态性研究进展
• 5.1.4 PRL受体基因
• 5.2 IGF-Ⅰ基因结构及多态性研究进展
• 5.2.1 IGF-Ⅰ基因结构
• 5.2.2 IGF基因表达及调控
• 5.2.3 IGF-Ⅰ基因的研究进展
• 5.3 GH基因及其多态性研究进展
• 5.3.1 GH基因的基本特征
• 5.3.2 GH基因与产奶量的关系
• 5.3.3 GH基因多态性研究进展
• 前言
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物样本来源
• 1.2 实验主要试剂
• 1.3 其他试剂
• 1.4 试剂盒
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 主要试剂和溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 血样的采集
• 2.2 牦牛血样基因组DNA的提取
• 2.3 用于SSCP分析的PCR扩增所用引物
• 2.4 用于RFLP分析的PCR扩增所用引物
• 2.5 PCR扩增与产物检测
• 2.6 扩增产物的PCR—SSCP分析
• 2.7 扩增产物的PCR—RFLP分析
• 2.8 克隆测序
• 3 数据的统计与分析
• 3.1 基因频率和基因型频率的计算
• 2独立性检验）'>3.2 基因频率和基因型频率的差异显著性检验（x²独立性检验）
• 3.3 位点遗传纯合度（Ho）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne）
• 3.4 多态信息含量（PIC）
• 3.5 统计分析模型
• 第三章 结果与分析（Ⅰ）候选基因多态性检测
• 1 牦牛基因组DNA样品的检测
• 2 IGF-Ⅰ基因PCR-SSCP多态性检测
• 2.1 IGF-Ⅰ基因第1外显子PCR-SSCP多态性检测
• 2.2 IGF-Ⅰ基因第1内含子PCR-SSCP多态性检测
• 2.3 IGF-Ⅰ基因第3外显子PCR-SSCP多态性检测
• 2.4 IGF-Ⅰ基因5′侧翼区PCR-SSCP多态性检测
• 2.5 IGF-Ⅰ基因第5外显子PCR-SSCP多态性检测
• 3 GH基因PCR-SSCP多态性检测
• 3.1 GH基因第3外显子PCR-SSCP多态性检测
• 3.2 GH基因第5外显子PCR-SSCP多态性检测
• 3.3 GH基因保守区PCR-SSCP多态性检测
• 4 PRL基因PCR-SSCP多态性检测
• 4.1 PRL基因第1外显子PCR-SSCP多态性检测
• 4.2 PRLR基因第2外显子PCR-SSCP多态性检测
• 4.3 PRLR基因第3外显子PCR-SSCP多态性检测
• 5 GHR基因PCR-RFLP多态性检测
• 5.1 GH-1R的PCR-RFLP检测结果
• 5.2 GH-2R的PCR-RFLP检测结果
• 第四章 结果与分析（Ⅱ）群体遗传结构
• 1 IGF-Ⅰ基因多态位点群体遗传学分析
• 1.1 五个牦牛群体IGF-Ⅰ基因型、等位基因频率分析
• 2适合性检验'>1.2 牦牛群体多态位点IGF-Ⅰ基因型Hardy-weinberg平衡的x²适合性检验
• 2独立性检验'>1.3 IGF-Ⅰ基因五个牦牛群体多态位点基因型分布x²独立性检验
• 1.4 IGF-Ⅰ基因群体多态信息含量、杂合度、有效等位基因数分析
• 2 GH基因多态位点群体遗传学分析
• 2.1 五个牦牛群体GH基因型、等位基因频率分析
• 2适合性检验'>2.2 五个牦牛群体多态位点基因型Hardy-weinberg平衡的x²适合性检验
• 2独立性检验'>2.3 五个牦牛群体多态位点GH基因型分布x²独立性检验
• 2.4 群体多态信息含量、杂合度、有效等位基因数分析
• 3 PRL基因多态位点群体遗传学分析
• 3.1 五个牦牛群体PRL基因型、等位基因频率分析
• 2适合性检验'>3.2 PRLR基因位点多态性Hardy-weinberg平衡的x²适合性检验
• 2独立性检验'>3.3 五个牦牛群体多态位点PRLR基因型分布x²独立性检验
• 3.4 牦牛群体PRLR多态信息含量、杂合度、有效等位基因数分析
• 4 IGF-Ⅰ基因对生长发育的影响
• 4.1 大通牦牛群体IGF-Ⅰ基因位点与6月龄体尺性状的分析
• 4.2 大通牦牛群体内IGF-Ⅰ基因各位点与18月龄体尺性状的分析
• 4.3 大通牦牛群体体尺指标与甘南牦牛和天祝白牦牛群体公牛群体比较
• 4.4 大通牦牛群体体尺指标与甘南牦牛和天祝白牦牛群体母牛群体比较
• 4.5 GH3对生长发育的影响
• 4.6 GH4对生长发育的影响
• 第五章 讨论
• 1 PCR-SSCP影响因素分析
• 2 五个牦牛群体的IGF-Ⅰ遗传特征分析
• 3 五个牦牛群体的催乳素及其受体遗传特征分析
• 4 生长激素部分基因PCR-RFLP结果
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介