烟夜蛾触角气味结合蛋白基因克隆、序列分析及真核表达载体的构建

论文摘要

昆虫能够感受空气中的挥发性物质,并依此作为寻偶、觅食和寻找产卵场所的信息。而昆虫触角感受器中的气味结合蛋白被认为是运输气味分子至嗅觉的受体,这些气味受体多为脂溶性的小分子化合物,气味结合蛋白溶解并运输脂溶性气味化合物。是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应,对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义。利用这一特性来检测和诱杀害虫是一个有效的预测和防治途径,这种方法和其它方法具有很好的兼容性,并且不污染环境,不杀伤天敌。该论文开展了烟夜蛾触角气味结合蛋白（PBP、GOBP1）基因的克隆、序列分析、原核及真核表达载体构建的研究。 根据已发表的其它昆虫的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增了编码烟夜蛾雌雄虫触角气味结合蛋白GOBP1和PBP的cDNA片断,并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM-T Easy载体（GenBank登录号为AY864774和AY864775）,获得了GOBP1和PBP基因成熟蛋白阅读框序列。将目的片断和原核表达载体PGEX-4T-1经双酶BamHI和EcoRI酶切重组到表达型质粒中,并转化入原核细胞中表达。序列测定结果表明,烟夜蛾触角普通气味结合蛋白基因1的成熟蛋白阅读框全长441bp,编码147个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为17.2KD和4.71。性气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长405bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.1KD和5.2。推导的GOBP1氨基酸序列与已报道的5种昆虫普通气味结合蛋白1高度同源达74%～99%,并具有气味结合蛋白的典型特征。PBP氨基酸序列与已报道的8种昆虫性气味结合蛋白同源性高,达40%以上,并具有气味结合蛋白的典型特征。其中与棉铃虫的同源性最高。丰富了昆虫气味结合蛋白家族,克隆出的GOBP1和PBP连接到原核表达载体中,为下一步获得大量的OBP重组蛋白打下坚实基础。 随着分子生物学技术的发展,微生物表达系统被广泛应用于外源基因产物的生产,基于酵母菌都有的一些特点。本实验采用粟酒裂殖酵母表达系统和毕赤酵母表达系统两种真核表达系统,真核表达系统虽然操作相对复杂,成本较高,但是有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工,背景蛋白少,纯化简单等诸多优点。粟酒裂殖酵母可以具有很多高等真核生物的性质,使得粟酒裂殖酵母在分子生物学研究中成为一种提供准确信息的真核生物模型,但目前表达目的蛋白还不是很多;毕赤酵母是一种嗜甲醇单细胞真核生物,依据利用甲醇的高低,可分为Mut+和Muts。作为表达外源基因的系统,该表达系统已经是成熟的表达系统,表达出大量的外源蛋白。两种系统都具有高表达、高分泌、高稳定的特点。烟夜蛾普通气味结合蛋白2基因整合入真核表达载体pPIC9k,构建毕赤酵母表达载体pPIC9k-GOBP2,并已经检测出阳性重组子;烟夜蛾普通气味结合蛋白2基因整合入真核表达载体PESP-2,构建了粟酒裂殖酵母表达载体PESP-2-GOBP2,也检测出阳性重组子。为下一步获得大量GOBP2重组蛋白,研究GOBP2蛋白的结构及配体的研

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 烟青虫触角气味结合蛋白
• 1.1.1 信息化合物
• 1.1.2 昆虫的化学感受器
• 1.1.3 昆虫触角气味结合蛋白的研究进展
• 1.1.4 气味嗅觉受体与气味降解酶
• 1.2 酵母表达系统研究进展
• 1.2.1 粟酒裂殖酵母表达系统的研究进展
• 1.2.2 毕赤酵母表达系统的研究进展
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 气味结合蛋白基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 研究内容和技术路线
• 3.1.2 材料
• 3.1.3 方法
• 3.2 裂殖酵母表达载体的构建
• 3.2.1 研究内容和技术路线
• 3.2.2 材料
• 3.2.3 方法
• 3.3 毕赤酵母表达载体的构建
• 3.3.1 研究内容和技术路线
• 3.3.2 材料
• 3.3.3 方法
• 4 结果和分析
• 4.1 GOBP1和PBP基因克隆及序列分析
• 4.1.1 GOBP1和PBP基因的扩增和克隆
• 4.1.2 GOBP1序列测定和分析
• 4.1.3 PBP序列测定和分析
• 4.1.4 烟青虫触角GOBP／PBP基因原核表达载体的构建
• 4.1.5 序列测定
• 4.2 裂殖酵母真核表达
• 4.2.1 GOBP2裂殖酵母真核表达载体的构建
• 4.2.2 重组载体转化到酵母细胞后的菌落PCR的检测
• 4.3 毕赤酵母真核表达
• 4.3.1 GOBP2毕赤酵母真核表达载体的构建
• 4.3.2 重组载体转化到酵母细胞后的菌落PCR的检测
• 5 结果和讨论
• 5.1 GOBP1和PBP基因克隆及序列分析
• 5.1.1 结论
• 5.1.2 讨论
• 5.2 裂殖酵母真核表达载体的构建
• 5.2.1 结论
• 5.2.2 讨论
• 5.2 毕赤酵母真核表达载体的构建
• 5.3.1 结论
• 5.3.2 讨论
• 参考文献
• 英文摘要