β-酪啡肽-7对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用及其机制研究

β-酪啡肽-7对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用及其机制研究

论文摘要

本研究选用健康雄性SD大鼠,以链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导糖尿病大鼠肾病模型,研究乳源活性肽β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7, p-CM-7)对糖尿病肾病大鼠肾脏功能和组织学变化、肾脏氧化应激、肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)及肾脏肾素-血管紧张素系统(RAS)的影响;细胞水平上揭示AngⅡ作用对大鼠肾小管上皮细胞的影响,并深入研究和阐明β-CM-7增强大鼠抵抗肾脏损伤的作用机制。研究包括四个部分:1β-酪啡肽-7对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用研究β-CM-7对链脲佐菌素(STZ)诱导的试验性糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的保护作用。40只SD大鼠随机取8只作为正常对照组(Control group),其余大鼠腹腔注射STZ(60mg/kg体重)溶液制造糖尿病模型。造模成功大鼠分为模型组(Model group)和β-酪啡肽-7组(β-CM-7group)。β-CM-7组大鼠每天灌胃7.5×10-6mol/kg体重的β-CM-7,其它两组大鼠分别灌胃等量的生理盐水。观察大鼠每天的饮水、采食及体重等变化,每5天测定空腹血糖1次。连续灌胃30天后处死所有大鼠,取血清、肾脏组织等,每组随机选取8只进行如下试验:1)测定大鼠尿糖、尿蛋白、肾功能相关指标和血清中胰岛素及胰高血糖素的含量;2)HE、Masson及天狼星红(Sirius red)染色分析大鼠肾脏组织病理变化及肾脏胶原纤维的变化;3)定量分析大鼠肾脏Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)和Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)的mRNA和蛋白表达变化。结果:1)32只大鼠用于造模,27只造模成功,造模成模率84%。试验期间,模型对照组大鼠出现多饮、多食、体重下降等临床症状,血糖一直维持在16.7mmol/L以上,血清中胰岛素含量显著降低(P<0.05),胰高血糖素含量显著升高(P<0.05)。与模型组大鼠比较,β-CM-7组大鼠的采食量、饮水量和空腹血糖值均有降低,体重略有升高;2)成模30天后,模型组大鼠尿糖、尿蛋白,血清肌酐、尿素氮含量均明显高于对照组(P<0.05),肾脏指数明显增高(P<0.01),病理组织学变化明显;β-CM-7干预后,上述指标水平均有降低,组织损伤减轻;3)模型组大鼠在肾小球和肾小管间质出现了大量的胶原纤维沉积,肾脏中Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达均显著高于对照组大鼠(P<0.05)。与模型组大鼠比较,β-CM-7组大鼠胶原纤维沉积明显减少。结论:腹腔注射STZ可用于诱导糖尿病大鼠肾病模型,首先该模型大鼠表现多饮、多食、体重下降。成模30天后,表现为糖尿,蛋白尿,’肾脏肥大、肾功能受损及肾脏纤维化等糖尿病肾病特征性病变;β-CM-7对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肾损伤有一定的保护作用。2β-CM-7对糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制初探上一章的研究发现p-CM-7具有缓解糖尿病肾病大鼠肾脏功能损伤及组织纤维化的作用,对糖尿病肾损伤具有一定的保护作用。本章将从肾脏氧化应激和肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(Tubular Epithelial-Myofibroblas transdifferentiation, TEMT)两个方面探讨其可能的机制。试验大鼠及处理同第一章。取第一章各组大鼠肾脏进行如下试验:1)生化法测定肾脏组织中MDA和H202含量,SOD, GPx (?)勺酶活及T-AOC;2) Real-time PCR定量测定大鼠肾脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(vimentin)和角蛋白19(CK19)的mRNA表达水平Western-blot和免疫组化法检测α-SMA和E-cadherin蛋白的表达与分布。结果:1)模型组大鼠肾脏组织中抗氧化酶SOD和GPx活性均显著低于对照组(P<0.01), MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,β-CM-7组大鼠肾脏组织中SOD和GPx酶活力均显著升高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.05);T-AOC和H2O2介于对照组和模型组之间,无统计学意义(P>0.05);2)与对照组大鼠相比,模型组大鼠肾脏α-SMA(P<0.01)和波形蛋白(P<0.05)mRNA表达水平显著升高,E-cadherin (P<0.05)和CK19(P<0.01) mRNA的表达水平显著降低。与模型组大鼠比较,β-CM-7显著降低了α-SMA和波形蛋白mRNA表达水平(P<0.05),升高E-cadherin (P<0.05)和CK19(P<0.01)mRNA表达水平;3)免疫组化结果显示模型组大鼠E-cadherin在肾小管中的分布明显减少,α-SMA分布有所增多,肾小管出现了转分化。β-CM-7拮抗了这种变化,两种蛋白的蛋白表达结果与mRNA表达结果一致。结论:β-CM-7能够抑制糖尿病肾病大鼠肾脏的氧化应激和肾小管上皮-肌成纤维细胞的转分化。增强抗氧化能力,抑制TEMT可能是β-CM-7保护糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制之一3β-CM-7对糖尿病肾病大鼠肾局部肾素-血管紧张素系统的影响上一章的结果提示β-CM-7保护糖尿病肾病大鼠肾损伤的作用可能与其增强肾脏抗氧化能力,抑制肾小管上皮-肌成纤维细胞的转分化有关。本章将从肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)途径进一步探讨3-CM-7保护糖尿病肾病大鼠肾损伤的新的机制。试验大鼠及处理同第一章。取第一章各组大鼠肾脏进行如下试验:放射免疫法(RIA)测定大鼠肾脏组织中AngⅡ的含量;Real-time PCR检测大鼠肾脏组织中ACE、AT1、ACE2和MAS的mRNA表达;Western blot检测大鼠肾脏组织中ACE和ACE2蛋白的表达。结果:1)与对照组大鼠比较,模型组大鼠肾脏组织中AngⅡ的含量极显著升高(P<0.01);灌胃β-CM-7后降低了肾脏局部AngⅡ (P=0.035)的含量,但仍高于对照组;2)与对照组比较,模型组大鼠肾脏组织中ACE2mRNA及蛋白的表达均显著降低(P<0.05),ACE mRNA和蛋白及AT1受体mRNA的表达显著升高(P<0.05), MAS mRNA表达略有降低,差异不显著(P=0.09)。β-酪啡肽-7显著上调了ACE2mRNA及蛋白的表达(P<0.05),ACE mRNA和蛋白及AT1受体的mRNA表达均降低(P<0.05), MAS mRNA的表达水平略有升高(P=0.07);3)模型组大鼠肾脏中ACE/ACE2mRNA和ACE蛋白/ACE2蛋白的比值均显著高于对照组(P<0.01);灌胃β-CM-7后,两比值均显著降低(P<0.05)。结论:糖尿病肾病时,肾脏局部RAS处于激活状态,ACE-AngⅡ-AT1轴活性占优势,高水平的AngⅡ参与了肾脏的损伤及纤维化。β-CM-7能够通过升高ACE2的表达,降低AngⅡ的高水平和AT1受体的表达,抑制RAS的过度激活,抑制糖尿病肾病大鼠的肾损伤。AngⅡ是糖尿病肾病大鼠肾损伤的关键因素,也可能是β-CM-7抑制糖尿病肾病大鼠肾损伤的关键通路。4β-CM-7对AngⅡ刺激的肾小管上皮细胞氧化应激及转分化影响的细胞学研究在细胞水平上深入探讨β-CM-7对AngⅡ诱导的细胞氧化应激及肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)(?)(?)影响及其机制。方法采用DMEM培养基对NRK-52E肾小管上皮细胞进行体外培养,细胞分为对照组(Control group)、AngⅡ处理组(AngⅡ group)、β-酪啡肽-7干预组(β-CM-7group)及AT1受体阻断剂组(ARB group)。AngⅡ处理组于培养基中添加1nM的AngⅡ,β-CM-7干预组于培养基中加入1nM的AngⅡ及10-5M的β-CM-7, AT1受体阻断剂组于培养基中添加1nM的AngⅡ及10-5mol/L洛沙坦,对照组等量DMEM培养液;处理72h后,收集细胞及上清。生化法检测肾小管上皮细胞中氧化应激及抗氧化应激指标;Real-time PCR检测肾小管上皮细胞转分化、RAS主要因子及转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)等相关蛋白的mRNA表达;Western-blot及免疫荧光检测细胞转分化、RAS等相关蛋白的表达;RIA及ELISA分别检测细胞上清中AngⅡ及TGF-β1的含量。结果:1)AngⅡ处理NRK-52E肾小管上皮细胞,其中ROS及MDA的含量显著升高(P<0.01),SOD及GPx的活性显著降低(P<0.01),细胞发生氧化应激;β-CM-7干预可显著降低ROS及MDA的含量,升高SOD及GPx的活性;2) AngⅡ处理能够上调NRK-52细胞中α-SMA的mRNA及蛋白表达(P<0.01),下调E-cadherin mRNA及蛋白表达(P<0.01),AT1受体阻断剂可以拮抗这种作用。β-CM-7处理能够显著抑制AngⅡ引起α-SMA及E-cadherin的表达变化;3)AngⅡ处理的NRK-52E细胞中ACE2mRNA及蛋白的表达显著降低(P<0.05),ACE mRNA(P<0.01)及蛋白(P<0.05)的表达显著升高,TGF-β1的含量显著升高;β-CM-7干预显著上调了细胞中ACE2mRNA及蛋白的表达,下调ACE mRNA及蛋白的表达,AngⅡ及TGF-β1的含量均降低。结论:AngⅡ可以通过AT1受体,升高TGF-β1,介导NRK-52E细胞氧化应激及转分化; β-CM-7能够有效抑制AngⅡ介导的肾小管上皮细胞的氧化应激及转分化;其机制是:升高ACE2的表达,抑制ACE的表达,降低AngⅡ及TGF-β1的含量

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 本文部分縮写的中英文对照
  • 引言
  • 第一篇 文献综述
  • 第一章 肾小管上皮细胞转分化与糖尿病肾病的研究进展
  • 1 上皮-间质细胞转分化概述
  • 2 肾小管上皮细胞转分化
  • 2.1 肾小管上皮细胞转分化的概述
  • 2.2 肾小管上皮细胞转分化的主要标志物
  • 2.3 肾小管上皮细胞转分化的过程及特征
  • 2.4 影响肾小管上皮细胞转分化的因素
  • 3 肾小管上皮细胞转分化与糖尿病肾病
  • 4 肾小管上皮细胞转分化与糖尿病肾病的治疗
  • 5 结语
  • 第二章 肾素-血管紧张素系统与氧化应激在糖尿病肾病中的作用
  • 1 糖尿病肾病与氧化应激
  • 1.1 糖尿病肾病概述
  • 1.2 氧化应激概述
  • 1.3 氧化应激在糖尿病肾病中作用
  • 2 糖尿病肾病与肾素-血管紧张素系统
  • 2.1 肾素-血管紧张素系统
  • 2.2 肾脏局部RAS
  • 2.3 RAS在糖尿病肾病中的研究进展
  • 3 糖尿病肾病时肾素-血管紧张素系统与氧化应激的相互关系
  • 第三章 乳源β-酪啡肽的生理功能及研究进展
  • 1 乳源生物活性肽
  • 2 β-酪啡肽及其研究进展
  • 2.1 β-酪啡肽的发现
  • 2.2 β-酪啡肽的结构特征
  • 3 β-酪啡肽的主要生理功能及研究进展
  • 3.1 对胃肠道的影响
  • 3.2 对免疫功能的影响
  • 3.3 对生殖内分泌的影响
  • 3.4 对采食的影响
  • 3.5 镇痛、镇静作用
  • 3.6 对神经系统和记忆的影响
  • 3.7 对血糖、糖尿病及糖尿病并发症的影响
  • 3.8 其它作用
  • 参考文献
  • 第二篇 试验研究
  • 第一章 β-酪啡肽-7对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料与试剂
  • 1.2 仪器与设备
  • 1.3 试验动物及处理
  • 1.4 测定指标与方法
  • 1.5 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 β-酪啡肽-7对大鼠血糖的影响
  • 2.2 β-酪啡肽-7对大鼠采食量、饮水量和体重的影响
  • 2.3 β-酪啡肽-7对大鼠胰岛素和胰高血糖素含量的影响
  • 2.4 β-酪啡肽-7对大鼠肾脏功能相关生化指标的影响
  • 2.5 β-酪啡肽-7对大鼠肾脏指数和肾脏组织学的影响
  • 2.6 β-酪啡肽-7对大鼠肾组织中胶原蛋白mRNA表达的影响
  • 2.7 β-酪啡肽-7对大鼠肾组织中胶原蛋白表达的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 大鼠糖尿病肾病模型的建立
  • 3.2 β-酪啡肽-7对糖尿病肾病大鼠血糖和肾功能的影响
  • 3.3 β-酪啡肽-7对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化的影响
  • 4 小结
  • 参考文献
  • 第二章 β-CM-7对糖尿病肾病大鼠肾脏氧化应激和肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化的影响
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料与试剂
  • 1.2 仪器与设备
  • 1.3 试验动物及处理
  • 1.4 测定指标与方法
  • 1.5 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 β-CM-7对糖尿病肾病大鼠肾脏氧化应激的影响
  • 2.2 β-CM-7对大鼠肾脏细胞转分化相关蛋白mRNA表达的影响
  • 2.3 β-CM-7对大鼠肾脏中E-钙粘蛋白和α-SMA蛋白表达的影响
  • 2.4 大鼠肾脏组织中E-钙粘蛋白和α-SMA表达的结果
  • 3 讨论
  • 3.1 β-CM-7对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响
  • 3.2 β-CM-7对糖尿病肾病大鼠上皮细胞转分化(TEMT)的影响
  • 3.3 糖尿病肾病大鼠氧化应激和TEMT的关系
  • 4 小结
  • 参考文献
  • 第三章 β-CM-7对糖尿病肾病大鼠肾局部肾素-血管紧张素系统的影响
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料与试剂
  • 1.2 仪器与设备
  • 1.3 试验动物及处理
  • 1.4 测定指标与方法
  • 1.5 数据统计与分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 β-酪啡肽-7对大鼠肾脏组织中AngⅡ含量的影响
  • 2.2 β-酪啡肽-7对大鼠肾局部ACE,ACE2,AT1及MAS mRNA表达的影响
  • 2.3 β-酪啡肽-7对大鼠肾脏组织中ACE及ACE2蛋白表达的影响
  • 2.4 ACE mRNA/ACE2 mRNA和ACE蛋白/ACE2蛋白比值分析
  • 3 讨论
  • 3.1 ACE-AngⅡ-AT1通路与糖尿病肾病
  • 3.2 ACE2-Ang(1-7)-MAS通路与糖尿病肾病
  • 3.3 ACE-AngⅡ-AT1和ACE2-MAS两条通路在糖尿病肾病中的相互作用
  • 4 小结
  • 参考文献
  • 第四章 β-CM-7对AngⅡ刺激的肾小管上皮细胞氧化应激及转分化影响的细胞学研究
  • 摘要
  • 1 材料及方法
  • 1.1 细胞来源
  • 1.2 试剂与材料
  • 1.3 仪器与设备
  • 1.4 主要试剂的配制
  • 1.5 方法
  • 1.6 数据统计与分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 β-酪啡肽-7对AngⅡ刺激的NRK-52E细胞氧化应激的影响
  • 2.2 β-CM-7对AngⅡ刺激的NRK-52E细胞转分化的影响
  • 2.3 β-CM-7对AngⅡ处理的NRK-52E细胞RAS的影响
  • 3 讨论
  • 3.1 AngⅡ与NRK-52E肾小管上皮细胞氧化应激
  • 3.2 AngⅡ与NRK-52E肾小管上皮细胞转分化
  • 3.3 β-CM-7通过AngⅡ抑制肾小管上皮细胞转分化与氧化应激及其机制
  • 4 小结
  • 参考文献
  • 总体讨论
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 本文创新点
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间论文发表情况
  • 附录
  • 相关论文文献

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