小麦耐盐、抗病转基因育种研究

论文题目: 小麦耐盐、抗病转基因育种研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 薛哲勇

导师: 夏光敏

关键词: 普通小麦品系种,耐盐高羊茅品种,农杆菌介导的小麦基因转化,液泡型,逆向转运蛋白基因,硫堇基因

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一,在我国北方地区(除东北外),粮食作物以小麦为主。但是在日益恶化的环境条件下,包括土地盐渍化和沙漠化、各种虫害、以及细菌和真菌感染,小麦生产受到了严重影响。解决这一问题最有效的手段是培育抗逆性强的小麦品种。除了常规育种以外,上个世纪90年代以来发展起来的植物基因工程技术,特别是农杆菌介导的单子叶植物转基因方法的突破,以及各类与抗逆和抗病相关的植物功能基因的大量克隆,使农作物的抗逆和抗病基因工程方兴未艾。本论文研究小麦农杆菌介导的转基因方法,并且探讨Na~+/H~+逆向转运蛋白基因对小麦抗盐,以及抗真菌的α-thionin(硫堇)基因DB4对小麦抗白粉病的作用。 1.Na~+/H~+逆向转运蛋白基因AtNHX1对小麦耐盐的作用盐碱地对于植物生长的影响主要是通过Na~+对细胞的毒害作用引起。为了提高小麦在盐碱地中的产量,获得耐盐的小麦新种质和新品系,我们将来自拟南芥的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因AtNHX1通过农杆菌介导的基因转化方法导入小麦品种,获得的转基因小麦后代遗传和表达了Na~+/H~+逆向转运蛋白基因,并通过Na~+在液泡中的区隔化,减少细胞质中Na~+浓度,从而提高植株的耐盐性。本实验采用了两种农杆菌侵染方式:1) 幼胚和愈伤组织侵染,2) 茎尖生长点浸染。 1) 幼胚和愈伤组织侵染将小麦品种烟优361、烟103、核生3号的幼胚,幼胚来源的幼龄胚性愈伤组织和培养多年的胚性愈伤组织,用含报告基因nptⅡ和35S启动子驱动的目的基因AtNHX1的农杆菌菌株GV3101,AGL1,EHA105感染和共培养后,用50-150mg/L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织及转化植株。用AtNHX1基因的特异引物对抗性植株的总DNA进行PCR检测,PCR阳性频率为1.3%(烟103)和2.9%(核生3号)。进一步用基因组的Southern杂交证实了AtNHX1基因已经整合到小麦基因组中,并以单拷贝和双拷贝形式存在。染色体原位杂交实

论文目录:

中文摘要

英文摘要

符号说明

第一部分文献综述

1．小麦基因转化方法

1．1 PEG介导法

1．2 激光微束法

1．3 电击法

1．4 微粒轰击法

1．5 花粉管通道法

1．6 农杆菌介导法

1．7 其他方法

2．外植体类型的选择

3．筛选方法

4．外源基因检测方法

5．转基因植物的表达分析方法

6．植物盐害和耐盐机理研究进展

6．1 盐害机理

6．1．1 盐分积累的过程

6．1．2 渗透胁迫作用

6．1．3 Na+的离子毒害作用

6．1．4 氧化胁迫作用

6．2 植物耐盐机制

6．2．1 根细胞的选择吸收作用

6．2．2 木质部的选择性运输

6．2．3 韧皮部转运和外排

6．2．4 细胞内的区隔化

6．2．5 渗透调节

6．2．6 活性氧(ROS)在细胞内的清除机制

6．2．7 双子叶和单子叶植株耐盐机理的差别

6．3 培育耐盐农作物的方法

6．4 植物耐盐性的主要生理和生化指标

6．4．1 发芽率、发芽指数和活力指数

6．4．2 成活率和生长量

6．4．3 籽粒重和产量

6．4．4 Na~+，K~+，K~+/Na~+

6．4．5 其他生理生化指标

6．4．6 区分渗透胁迫和离子胁迫

7．植物耐盐的分子机制研究现状

7．1 植物的盐胁迫信号转导途径

7．2 植物对盐胁迫的应答基因及其耐盐机制

7．3 Na~+/H~+逆向转运蛋白的研究进展

7．3．1 蛋白分子结构的特点

7．3．2 类型和同源性

7．3．3 生化特性和主要生理功能

7．3．4 表达模式及与耐盐性的关系

7．3．5 逆向转运蛋白的信号途径

8．抗菌肽研究进展

8．1 抗菌肽的分子结构和生物学效应

8．2 抗菌肽的基因结构

8．3 抗菌肽的作用机理

8．4 抗菌肽基因工程

实验的目的和意义

第二部分材料和方法

1．农杆菌转化的受体材料

2．培养基种类及成分

3．农杆菌菌株和载体

4．转化

5．筛选和再生

6． PCR检测

6．1 DNA的提取

6．2 PCR引物

6．3 扩增体系

6．4 扩增程序

6．5 电泳

7． Southern杂交

7．1 大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化

7．2 质粒提取

7．3 质粒酶切及探针片段的回收

7．4 DNA提取

7．5 基因组 DNA的酶切和电泳

7．6 转膜

7．7 探针标记

7．8 杂交及检测

8．染色体原位杂交

8．1 药品

8．2 染色体制备

8．3 探针标记

8．4 杂交

8．5 信号产生和检测

9． RT-PCR分析

9．1 Trizol法提取叶片总RNA

9．2 总 RNA的纯化

9．3 RT-PCR的体系和程序

10． T_2代遗传分析

11．种子萌发率分析

12．生长量分析

13．成活率分析

14． Na~+，K~+分析

15．耐盐小麦后代的田间产量分析

16．离体叶段法白粉病抗性分析

17．大田抗白粉病分析

18．生长点浸染法

19．快速扩增cDNA末端

19．1 5’RACE的一链cDNA合成

19．2 5’RACE扩增

19．3 3’RACE的一链cDNA合成

19．4 3’RACE扩增基本步骤

第三部分结果和分析

实验一液泡型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因对小麦的转化及转基因后代的耐盐性分析

1．抗性植株再生

2． PCR分析结果和转化频率

3． Southern杂交分析结果和外源基因的拷贝数

4．转基因植株及后代的遗传分析

5．染色体原位杂交结果

6． RT-PCR分析结果

7．成活率分析

8．种子萌发率分析结果

9．生长量分析结果

10．耐盐小麦后代的田间产量分析结果

11． Na~+，K~+分析结果

12． Ubinqutin启动子对pROK_2/AtNHX1基因转化小麦的影响

实验二高羊茅Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆

1．材料来源

2．高羊茅(绿洲)Na~+/H~+逆向转运蛋白基因FaNHX1部分片断的克隆

3． Na~+/H~+逆向转运蛋白基因FaNHX1 3~、末端的获得

4． Na~+/H~+逆向转运蛋白基因FaNHX1 5~、末端的获得

5． Na~+/H~+逆向转运蛋白基因全长cDNA的获得

实验三根瘤农杆菌介导将大麦叶片型α-硫荃基因DB4导入小麦获得转基因植株及后代

1．转基因植株的再生

2．抗性植株的PCR和 Southern杂交分析

3．转基因植株后代的遗传

4．转基因植株后代的离体白粉病抗性分析

5．转基因植株后代的大田抗白粉病分析和遗传分析

第四部分讨论

1． Na~+/H~+逆向转运蛋白基因和α-thionin基因在提高小麦耐盐和抗白粉病中的作用

1．1 Na~+/H~+逆向转运蛋白在转基因小麦中的作用机制

1．2 α-thionin基因对提高小麦白粉病抗性的作用

2．小麦农杆菌转化的影响因素

2．1 材料的基因型

2．2 转化材料的类型和状态

2．3 影响转化的其它因素:菌株类型及浓度、共培养温度和时间

2．4 筛选方式和筛选剂对效率的影响

3．外源基因的整合位点、拷贝数以及其与表达的关系

3．1 外源 DNA的整合位点和拷贝数

3．2 整合位点和表达效率的关系

4．转基因植物分子鉴定的主要问题以及解决办法

4．1 Southern杂交的难度

4．2 PCR检测假阳性和非特异性

4．3 PCR扩增条带不清晰或无扩增带

5．外源基因表达的RT-PCR分析以及需要注意的问题

参考文献

在读期间发表的文章、获奖情况和参与的课题

论文的创新性和不足之处

致谢

学位论文评阅及答辩情祝表

发布时间: 2005-10-17

参考文献

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