论文摘要
目的对我国部分地区的艰难梭菌临床分离株的tcdA、tcdB进行测序,并与国际上已公布的艰难梭菌分离株的tcdA、tcdB序列进行多态性分析和进化分析,了解不同型别菌株的tcdA、tcdB序列遗传特征,并探讨可能的进化特征,为深入开展流行病学调查、溯源、建立分子诊断技术奠定基础。方法选取不同来源的70株（66株来自中国不同地区）艰难梭菌临床分离株,进行毒素基因分型、MLST分型后,从genBank下载艰难梭菌630（rB+菌株）和M68（A-B+菌株）的基因做为模板,对tcdA、tcdB进行引物设计、sanger测序基因全长。测序结果使用DNA序列拼装软件进行序列拼装,得到测序重叠群（contigs）,再以艰难梭菌630和M68为模板,确定基因起始点和终止点。对获得的70株艰难梭菌的tcdA、tcdB序列,以及genBank上公布的其他25株菌的A、B基因,进行数据分析,包括：序列碱基比对与分型、多态性分析（SNP）、进化分析。另外,检索有关PCR法检测艰难梭菌tcdA、tcdB的文献,将查找到的引物与所获得的tcdA、tcdB序列型别进行比对,手工统计碱基差异数,分析引物情况。最后,根据多态性分析和引物比对结果,寻找特异位点设计引物,并进行临床菌株验证。结果此次研究我们成功的获取了66株来自中国不同地区的临床艰难梭菌的tcdA和tcdB序列,以及29株国外艰难梭菌的tcdB和／或tcdA序列,总共85个tcdA、95个tcdB序列。分析结果发现,A、B基因多态性明显,之前在genBank中未曾报道过的10个TST tcdA和5个TST tcdB序列菌株均分离自我国。tcdA序列的非同义突变SNP和碱基缺失主要发生在受体结合区,提示该区经历过激烈的正进化选择压力。tcdB序列没有发现大片段碱基缺失的现象,但是其SNP明显高于tcdA,且菌株间的突变率也要大于tcdA,进化速率更快,其非同义突变SNP集中于glucosyltransferase domain（主要表现在B12、B16）和receptor binding domain（主要表现在B13、B14、B15、B16）。这种现象提示,毒素基因或整个PaLoc区存在基因重组或HGT,有利于进化中的菌株保存其优势基因序列。我国菌株基因遗传特征与欧美不同,我国部分地区以A15B13 （ST37,A-B+）为优势菌株,根据tcdA、tcdB序列遗传特征和其耐药性推定这种型别的菌株很可能对我国部分地区临床和公共卫生控制存在潜在威胁。结论这是我国一次系统性地对艰难梭菌A、B基因进行的序列分析,也是对国际上tcdA、tcdB基因库的一个补充。我们再一次肯定了A、B基因的高多态性,不同的流行株其多态性各异,有自己的特征,且我国菌株基因遗传特征与欧美不同。我国艰难梭菌流行情况复杂,研究投入有限,但面临的形势复杂、严峻,A-B+菌株分离率高,迫切地需要建立一种更好更优化的适合我国的快速分子检测方法,便于大规模地鉴定、收集菌株,进行流行病学研究,获取基线资料,此次研究的毒素基因多态性为毒素基因分子检测方法做了很好的铺垫；同时我们还有必要尽快开展基础方面的研究,对菌株毒力等方面进行进一步的探讨和验证。