鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究

论文摘要

本文对四川省内地方品种四川麻鸭的干扰素进行如下系列研究:对四川麻鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析;构建IFN-αORF基因原核表达载体和真核表达载体;IFN-α原核表达及其生物学活性研究;利用雏鸭为模型,应用免疫组织化学方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒在鸭体内的动态表达分布规律;同时对作为免疫佐剂的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒免疫调节活性进行研究,获得以下结果:1.四川麻鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物对,采用PCR和nest-PCR的方法,从鸭肝脏组织基因组DNA扩增得到大小两个完全包含麻鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。其中小片段更适合用于表达,并将其进行pGEM-T载体克隆与测序,对测序结果采用ClustalX软件进行序列分析以及与北京鸭、鸡、鹅等NCBI上序列进行了比较。结果显示四川麻鸭与北京鸭ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.13%,氨基酸同源性为98.96%。与鸡的核苷酸及氨基酸同源性分别为71.8%、49.97-50.47%,与鹅的核苷酸同源性为96%。同时用BioEdit、NetNGlyc、TreeView软件对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明四川麻鸭有2个潜在糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation）和1个酪蛋白激酶Ⅲ磷酸化位点（Casein kinaseⅢphosphorylation site）,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,成熟的鸭α干扰素有5个疏水区,无跨膜区。2.SDIFN-αORF基因原核表达载体pBV220-SDIFN-α的构建及表达产物的抗病毒活性采用BamHI和EcoRI酶切,通过定向粘末段连接法,构建了原核表达载体pBV220-SDIFN-α质粒。并将质粒转化到原核表达菌株DH5α中进行表达,采用温度诱导的方式,对诱导后的菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示工程菌进行了表达,产生的包涵体蛋白分子量为40KD左右。对纯化后的包涵体采用稀释复性的方法复性,采用VSV/DEF系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为150U/ml,比活力为440U/mg。应用FQ-PCR检测方法,动态监测体内抑制DHBV和体外抑制DPV病毒核酸。结果发现,表达的干扰素具有强烈的病毒复制抑制作用,具有明显的生物学活性。3.SDIFN-αORF基因真核表达载体pcDNA-SDIFN-α的构建及鉴定利用合成在引物两端的EcoRI、BamHI酶切位点,将目的基因成功地从pGEM-T载体克隆重组体中切下,并通过粘端连接的方法,连接到pUC18定向位置上,然后用EcoRI和XbaI双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+）和pUC18-SDIFN-α,实现了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1（+）载体上。四川麻鸭IFN-α真核表达重组质粒pcDNA-SDIFN-α经BamHI、EcoRI和XbaI三种酶切验证,并测序证明四川麻鸭IFN-α的真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α构建正确。4.免疫组织化学检测真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内表达方法的建立及动态表达规律的研究以pcDNA-SDIFN-α真核质粒免疫鸭,分时间段采集鸭16种不同组织,建立了免疫组织化学检测方法,并应用该方法检测干扰素在体内的动态表达规律。pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后,持续表达时间长达9周。能在肺脏细胞、心肌细胞、肝细胞、脾细胞、肠腺和肠绒毛细胞、肌肉细胞、皮肤内检测到表达产物,在14d-35d进行了高峰表达。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未检测到阳性黄色颗粒,肺脏、免疫部位最早出现阳性颗粒,脑组织细胞中阳性颗粒数量随时间变化较小。其中基因枪免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组。肌肉注射免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为200μg组＞100μg组＞50μg组,都具有一定的剂量相关性。基因枪轰击法较肌肉注射法IFN-α基因表达出现的时间早,3h就可以检测到表达产物。同时,相对于肌肉注射法免疫,基因枪轰击法所用的表达质粒用量更少。5.真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内免疫调节剂活性的初步研究以pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒为免疫调节剂,研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用。分不同时间段采血,采用MTT法测定鸭外周血T淋巴细胞转化效果、CD3+T淋巴细胞数量变化和特异性DPV中和抗体IgG水平。结果表明,一定剂量的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒作为免疫调节剂在一定时间内能促进和提高细胞免疫和体液免疫应答,发挥着有效的正向免疫调节作用。

论文目录

中文摘要

英文摘要

缩略词表

第一部分文献综述

第一章干扰素研究进展

一、干扰素的种类和结构

二、干扰素生物学特点

三、禽类干扰素研究进展

四、兽医领域基因工程干扰素的应用研究

第二章佐剂及遗传佐剂研究进展

一、协同刺激分子（共刺激分子）佐剂

二、CpG DNA序列和脂质体

三、细胞因子佐剂

四、影响遗传佐剂效果的其他因素

第二部分实验研究

第三章四川麻鸭α干扰素基因的克隆及序列分析

1 实验材料

1.1 麻鸭

1.2 酶及试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 SDIFN-αORF基因的克隆

2.2 目的基因的序列测定与分析

3.结果与分析

3.1 PCR扩增产物

3.2 nest-PCR扩增产物

3.3 PCR和nest-PCR产物比较

3.4 重组质粒酶切鉴定结果

3.5 重组质粒的PCR鉴定结果

3.6 IFN-α序列

3.7 序列分析

3.8 糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点分析

3.9 信号肽预测

3.10 疏水性分析

3.11 跨膜区和高级结构分析

3.12 同源性分析和进化比较

4.讨论

4.1 引物设计

4.2 基因扩增

4.3 T载体克隆

4.4 生物信息学分析

5、小结

第四章鸭α干扰素基因原核表达载体构建及其表达产物的抗病毒活性

1 实验材料

2 实验方法

2.1 四川麻鸭IFN-α原核表达质粒的构建技术路线

2.2 SDIFN-α原核表达质粒的构建

2.3 重组质粒的鉴定

2.4 pBV220-SDIFN-α原核表达菌株的初步表达

2.5 鸭α-IFN包涵体纯化及复性

2.6 采用细胞病变抑制法（DEF/VSV系统）初步测定干扰素抗病毒活性

2.7 FQ-PCR检测干扰素抗病毒活性

3 结果与分析

3.1 菌株PCR扩增鉴定结果

3.2 pBV220-SDIFN-α质粒酶切鉴定结果

3.3 pBV220-SDIFN-α序列测定

3.4 pBV220-SDIFN-α的原核表达情况

3.5 表达产物抗病毒活性

4 讨论

4.1 关于表达系统及表达质粒的选择

4.2 关于感受态细胞的制备与转化

4.3 关于重组质粒的鉴定

4.4 关于基因表达

4.5 关于表达产物抗病毒活性测定

5 小结

第五章四川麻鸭α干扰素基因（SDIFN-α）真核表达载体构建

1 实验材料

2 实验方法

2.1 四川麻鸭IFN-α真核表达质粒的构建

2.2 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒的单双酶切鉴定

2.3 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒序列测定

3 结果与分析

3.1 四川麻鸭IFN-α基因的获取

3.2 pUC-SDIFN-α酶切鉴定结果

3.3 pcDNA-SDIFN-α酶切鉴定结果

3.4 pcDNA-SDIFN-α序列测定

4 讨论

4.1 构建SDIFN-α的真核表达重组体的意义

4.2 四川麻鸭IFN-α的真核表达载体的克隆

5、小结

第六章免疫组织化学检测鸭α干扰素方法的建立及鸭α干扰素真核表达质粒在免疫鸭体内的表达规律研究

1 实验材料

2、实验方法

2.1 真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α的大量提取

2.2 质粒的纯化

2.3 含pcDNA-SDIFN-α的基因枪子弹的制备

2.4 实验鸭免疫分组设计

2.5 采样时间与部位

2.6 兔抗鸭IFN高免血清的制备及其IgG提取纯化

2.7 兔抗鸭IFN-IgG的检测及分析

2.8 免疫组织化学法方法的建立

2.9 免疫组织化学结果判定

3、结果与分析

3.1 表达质粒纯化及检测

3.2 原核表达产物SDIFN—a抗原的制备

3.3 SDIFN—a蛋白的纯化

3.4 琼扩检测及分析

3.5 ELISA检测及分析

3.6 Western-Blotting检测及分析

3.7 免疫组织化学方法检测及真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α体内动态表达规律

4、讨论

4.1 质粒提取及纯化。

4.2 抗原抗体反应的检测

4.3 免疫组织化学检测表达规律。

5、小结

第七章鸭α干扰素真核表达质粒pCDNA-SDIFN-α免疫调节剂研究

1 实验材料

2 实验方法

2.1 质粒的制备及纯化

2.2 基因枪子弹的制备

2.3 动物分组和免疫

2.4 血样的采集和处理

2.5 淋巴细胞转化试验

2.6 CD3+T淋巴细胞数量的检测

2.7 血清IgG的检测

3 结果与分析

3.1 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV/DVH弱毒作用后鸭外周血T淋巴细胞转化效果

3.2 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DVH弱毒作用鸭后激发外周血CD3+T淋巴细胞数量的动态变化

3.3 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV弱毒作用鸭后血清抗体水平的动态变化

4 讨论

4.1 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对弱毒苗激发鸭外周血T淋巴细胞转化能力的影响

4.2 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对疫苗免疫鸭的外周血CD3+T淋巴细胞数量的影响

4.3 质粒pcDNA-SDIFN-α免疫途径、剂量、时间对疫苗免疫效果的影响

4.4 a-干扰素抗病毒活性与免疫调节的关系

5、小结

第三部分结论:

参考文献

附表免疫组织化学检测结果

附图免疫组织化学检测图谱

致谢

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