论文摘要
背景和目的:随着人民生活水平的提高及寿命的延长,慢性肾脏病（CKD）的发病率明显增高。慢性肾损害所致的尿毒症给病人带来了极大的痛苦及经济负担。因此探讨慢性肾损害的原发致病因素并采取早期干预措施有重大理论意义和临床实用价值。近年来,有关器官内淋巴管的超微结构及其循环障碍对组织影响的研究已有一些报道,尤其在脑、肝脏、胃肠等器官已取得了较大进展。然而,关于肾脏毛细淋巴管的超微结构以及循环障碍对肾脏影响的研究少见报道。早期曾有人研究过短时结扎犬肾门淋巴管后,对肾功能的影响,发现肾间质静水压增高,钠水排泄改变,尿量增加,随着时间延长,可出现肾间质的弥漫性损害。那么,肾脏淋巴循环和肾脏组织结构改变之间有着怎样的关系,又是通过何种机制起作用呢?至今尚无人深入研究。我们早期的预实验发现结扎大鼠肾淋巴管后,尿蛋白显著增加,随着时间推移肾功能逐渐减退,组织病理出现以肾小管间质损伤为主的改变,包括上皮细胞崩溃脱落坏死,小管萎缩,正常结构破坏,肾间质纤维化,肾小球系膜细胞及基质增生等。我们推测肾淋巴循环障碍将激发肾脏纤维化与肾脏细胞凋亡的发生。我们知道肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病的共同特征,几乎是所有终末期肾病（ESRD）的最终转归,而肾小管上皮细胞-间充质细胞转化（EMT）是肾间质纤维化的重要发病机制之一。上皮细胞-间充质细胞转化过程的经典调控因子为转化生长因子-β超家族成员。SMAD家族蛋白的主要作用是介导TGF-β家族的信号。细胞凋亡又称程序性的细胞死亡,随着对细胞凋亡研究不断深入,发现Bcl-2家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质。Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一,在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。Bcl-2和bax分别是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因,并且bax是bcl-2活性的主要调控因子。尽管,对肾间质纤维化和细胞凋亡的研究已较深入广泛,但肾淋巴循环障碍是否引起肾间质纤维化和细胞凋亡,TGF-β1/smad途径和bax/bcl-2途径在其中的作用如何却仍不清楚。本课题吸收国内外研究的最新成果,结合国内外肾脏病防治的迫切需要,通过动物试验,用结扎肾淋巴管的方法建立肾淋巴循环障碍大鼠模型,通过观察肾组织病理及功能变化用以证实肾淋巴循环障碍所导致的肾脏损害,通过对TGF-β/SMAD途径和Bcl-2/bax途径的相关分子蛋白的检测,阐明其肾间质纤维化及肾细胞凋亡的发生机制,为临床越来越多的不明原因的慢性肾损伤寻找新的原发致病因素。研究方法:1.鼠肾起始淋巴管的分布及形态学观察1.1 Wistar大鼠20只,雌雄不限。常规麻醉、手术开腹。每只动物取肾组织用免疫荧光双标法,即淋巴管标记物Podoplanin和血管内皮标记物CD34分别标记淋巴管和血管,应用Leica荧光显微镜在不同的通道（绿光激发光波长543nm;红色激发光波长633nm）分别观察并拍照,以观察鼠肾起始淋巴管在肾脏分布。1.2肾脏超微结构观察:在皮质,髓质及皮髓交界区取组织块置3%戊二醛固定液内,用透射电镜观察淋巴管超微结构,包括毛细淋巴管的一般特征、内皮细胞的连接、质膜小泡的形态和分布。2.对大鼠肾脏结构功能的观察2.1将大鼠分为两组:模型组和对照组,每组30只。用结扎肾淋巴管的方法建立了肾淋巴循环障碍大鼠模型。各组大鼠分别于术后第7、14、28、56天各处死6只。在处死前1日留取24小时尿标本,处死日留取血标本。尿蛋白和血清肌酐由全自动分析仪检测。Ccr按公式:尿肌酐浓度×每分钟尿量（ml）/血肌酐浓度计算,并以体重校正。以观察不同时间段大鼠尿蛋白、肾功能改变。2.2肾脏组织经固定、脱水、石蜡包埋,切片3μm厚度,做PAS、Masson染色。在光镜下观察肾脏病理改变,并根据小管损伤,小管间质纤维化和肾小球硬化标准作小管损伤指数,小管间质纤维化指数（TIFI）和肾小球硬化指数（GSI）的半定量分析。2.3留取约1mm3大小肾皮质经固定、包埋,切片厚50nm,观察肾脏超微结构改变。3.淋巴循环障碍促使肾间质纤维化的研究假手术组和模型组大鼠分别于术后第7、14、28、56天处死。留取肾组织标本提取组织蛋白、mRNA基因和制作石蜡切片。运用Real-time PCR、Western Blot和免疫组化检测检测TGF-β1、Smad2/3、P-smad2/3在肾脏组织的表达。4.肾淋巴循环障碍促使肾细胞凋亡的研究各组大鼠分别于术后第1、7、14、28天各处死6只,留取肾组织标本提取组织蛋白、mRNA基因和制作石蜡切片。运用Real-time PCR、Western Blot和免疫组化检测检测Bax、Bcl-2、Caspase3在肾脏组织的表达,用肾脏细胞原位凋亡（TUNEL）的方法检测肾脏凋亡细胞。结果:1.鼠肾起始淋巴管的分布及形态学观察1.1经免疫荧光双重染色,光镜下可见毛细血管呈红色、毛细淋巴管呈绿色,区别明显。淋巴管形态不规则,管腔大,壁薄。淋巴管主要位于富含结缔组织区,大鼠肾脏皮质淋巴管明显多于髓质。1.2电镜下见毛细淋巴管的形状极不规则,毛细淋巴管的管壁较薄,毛细淋巴管内皮细胞无窗孔,基膜很薄,不连续或缺如,可见细胞内通道样结构,淋巴管内皮细胞中富含细胞器和质膜小泡。内皮细胞以重叠连接为主,在内皮细胞的连接处可见有粘着装置。毛细淋巴管的内皮细胞中含有极其丰富、大小不等的质膜小泡。质膜小泡多数游离于细胞质内。2.对大鼠肾脏结构功能的观察2.1模型组大鼠于术后第1周即出现明显蛋白尿（P＜0.05）,随时间的延长而加重;模型组大鼠血肌酐水平在第2周时开始升高,（P＜0.05）,且随术后时间延长,有逐渐增高趋势;模型组Ccr水平从术后第2周起明显下降,以后随着术后时间的延长,不断下降。2.2模型组大鼠出现明显的组织病理改变,肾小管扩张明显,伴上皮细胞空泡变性,部分小管出现上皮细胞崩溃脱落,小管结构不完整。随术后时间延长出现肾小管萎缩,间质面积增宽,小管和间质结构消失,其中可见大量纤维组织增生。肾小球系膜区可见系膜细胞及基质增生。小管损伤指数,小管间质纤维化指数（TIFI）和肾小球硬化指数（GSI）较对照组明显增高,并随病程逐渐进展。2.3电镜下观察模型组于造模后1周即出现肾小管上皮细胞、肾小球足细胞水肿,胞质内空泡数目增加,线粒体肿胀,部分嵴消失部分线粒体嵴消失呈空泡状;足突融合、变平;系膜增生插入,基质呈高电子密度。3.淋巴循环障碍促使肾间质纤维化的研究3.1免疫组化显示,模型组大鼠在小管上皮及系膜区的TGF-β1、Smad2/3表达明显增强,在小管上皮细胞更为明显。ColⅠ在肾间质及肾小管上皮细胞的表达明显增高,而肾小球无明显变化。p-Smad2/3主要表达于肾小管上皮细胞,在肾小球系膜细胞的细胞核内也可见较强的p-Smad2/3的表达。3.2 Western印迹检测发现模型组TGF-β1、Smad2/3的蛋白表达量较对照组明显增加（P＜0.05）,在第1周开始就有p-Smad2/3蛋白表达,第2周后持续增高,以后维持在较高水平（P＜0.05）。3.3 Real-time PCR的检测显示ColⅠ、TGF-β1、Smad2、Smad 3的mRNA均于术后第1周开始增高,分别为同期对照组的4.5、1.6、1.7、1.8倍（P＜0.05）。4.肾淋巴循环障碍促使肾细胞凋亡的研究4.1应用TUNEL检测发现,在模型组大鼠阳性着色细胞显著增加,且细胞凋亡主要发生在扩张或萎缩的肾小管;模型组的凋亡指数在术后第一天开始升高（p＜0.05）,在第14天达到高峰（p＜0.01）。4.2免疫组化提示,模型组的Bax和caspase-3表达明显增强,主要位于小管间质,尤其在远端小管。相反,Bcl-2的表达明显减弱。4.3 Western blot分析显示,模型组大鼠Bax蛋白表达水平明显增加,在术后第14天达到高峰（p＜0.01）,以后维持缓慢增高趋势。然而Bcl-2蛋白表达从术后第一天开始明显下降。由此,Bax/Bcl-2比值明显增高。总caspase-3表达明显高于对照组（p＜0.01）,且其活化片段（17-kDa）表达也明显增高。4.4 Real-time PCR显示在所有时间段,模型组大鼠bax和caspase-3的mRNA表达显著增高,而bcl-2 mRNA表达却明显下降（p＜0.05）。同样Bax/Bcl-2比值也较对照组明显增高。结论:1.大鼠肾脏淋巴系统内大量质膜小泡和通道样结构的存在,正是肾脏转运大分子物质和组织液进入淋巴循环的生理基础。2.肾淋巴循环障碍对肾脏结构和功能有着明显的影响,肾脏功能减退和结构损害随循环障碍时间的延长而加重。3.在肾淋巴循环障碍导致的小管间质纤维化过程中,TGF—β1/Smad途径被高度激活,促进着上皮细胞的转型,在纤维化过程中起着积极作用。4.在肾淋巴循环诱导的肾脏功能和结构改变的过程中,细胞凋亡显著增加,其中Bax/Bcl-2途径发挥了积极作用。