ENO1基因在鼻咽癌发病中的作用研究

论文摘要

研究背景和目的：鼻咽癌好发于中国南方,特别是广东省,发病率最高因此又被称为“广东瘤”,是一种具有地域性和家族聚集性的高度恶性肿瘤。鼻咽癌的发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。流行病学调查显示,鼻咽癌的发生涉及到遗传倾向性和环境致癌因素,很可能是遗传易感性个体,接受了致癌物的作用而发生的。其中包括各种环境因素、EBV感染和遗传及表遗传学的改变导致瘤基因过表达及抑瘤基因表达下调或缺失,经过癌前病变,最终发生鼻咽癌。肿瘤的生成涉及多种基因和基因以外的变化,任何单独一种基因的改变不足以致瘤,多种基因变化的积累才能引起控制细胞生长和分化的机制紊乱,使细胞的生长失控而瘤变。在这些基因的变化中,最常发生两类基因的异常变化,即瘤基因及肿瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同样涉及多基因的表达改变。在过去几十年中,虽然我们对于鼻咽癌发生的分子基础认识已经有了很大的提高,但这些认识还是远远不能完全揭示鼻咽癌的发病机理。因此,鼻咽癌相关新基因的发现和研究仍将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。Enolasel基因的表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变,其主要编码两种蛋白。多数情况下,a-enolase（即ENO1）是烯醇化酶家族中3种同功酶之一,是一个高度保守的胞浆糖酵解酶,既可催化糖酵解过程中2-磷酸-D-甘油酸（PGA）向磷酸-烯醇式丙酮酸（PEP）的转化,又可在糖原合成过程中,催化逆向反应,即作为磷酸丙酮酸水合酶,使PEP向PGA转化,在细胞能量代谢过程中起重要的作用。另一种称为c—myc启动子结合蛋白（MBP—1）,不具有酶活性,可表达于细胞核,与核DNA c—myc启动子结合,负向调控c—myc的表达。c-myc基因是一种细胞核内癌基因,它编码的核内转化蛋白p62对正常细胞生长和分化起重要调节作用。c-myc表达活性与细胞生长分裂关系密切,据认为它是诱导增殖和凋亡双重作用的基因。正常情况下C-myc基因不显示转录活性或低水平表达。c-myc基因被激活后可致其产物p62过度表达而堆积在细胞内,使细胞获得永生。近年来多项研究表明c-myc基因在肿瘤的发生发展中起重要作用,其在肿瘤组织中的表达率与患者的生存期呈显著相关。这也提示ENO1除了作为糖酵解反应的限速酶外,还参与细胞的其他生物学活动。在早期对ENO1研究中发现,ENO1能够抑制肿瘤细胞的生长。但有趣的是,与前述ENO1抑制肿瘤细胞增生的作用截然不同,近年来越来越多的研究表明,ENO1在肿瘤发生及发展中所发挥的作用并非如早年研究所指出的,是一个具有潜在抑癌能力的基因。与之相反,近年来的研究结果不断表明,ENO1很可能是一个在肿瘤生发发展和转移等多个环节过程中均发挥作用的重要癌基因。目前提出ENO1可能具有癌基因功能的多项研究主要集中在肝癌、非小细胞肺癌、甲状腺嗜酸细胞瘤以及黑色素细胞瘤等肿瘤上。通过蛋白质组学,western blot和免疫组化等技术发现,ENO1在这些肿瘤的细胞系、活体组织中有较高水平表达。并且,多篇文献指出,在多种肿瘤患者的外周血中,检测出的ENO1自身抗体的水平与该类肿瘤的分化、分期及预后显示出明显的正相关关系。在对ENO1促进肿瘤细胞生长机制的探讨中,大多数认为ENO1在肿瘤细胞生长过程中的能量代谢过程中起到积极作用,尤其是大多数肿瘤在高代谢情况下,其生长对于糖酵解作用获能的依赖成为目前研究的重点。在增殖较快的肿瘤细胞中,ENO1有相对高水平的表达；而在非增殖的角质化细胞中,ENO1的合成明显减少。由于糖酵解过程的变化与细胞增殖有关,故推测,在肿瘤细胞增殖过程中,ENO1的表达可以通过影响糖酵解,三羧酸循环,以及随后的氧化磷酸化酶作用物的水平,进而影响ATP的合成,这对肿瘤细胞的生长十分重要。但目前有关ENO1在鼻咽癌中的作用的研究还未见报道。在本研究所方唯意等研究中,利用基因芯片技术对8组NPC病人标本及对照,两组细胞株进行了基因筛选,结果显示,在病理标本及细胞株中,ENO1的表达均显著提高。因此,本课题旨在研究ENO1在鼻咽癌细胞及组织中的表达特性,并进一步通过改变ENO1表达水平来观察其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。为进一步明确鼻咽癌的发病机制奠定良好的基础。方法：1.鼻咽癌中ENO1表达特性的鉴定及临床意义。利用免疫组化检测120例鼻咽癌与40例正常鼻咽中ENO1基因的表达情况。2.ENO1表达沉默对鼻咽癌细胞HONE1生物学特性的影响。荧光定量PCR检测鼻咽癌细胞系（6个细胞系,5-8F,6-10B,SUNE1,CNE2,CNE1,HONE1）中ENO1的表达情况,筛选高表达ENO1的细胞株。设计并体外化学合成针对ENO1基因的小干扰RNA序列,以脂质体（lipofectamineTM 2000）为载体转染鼻咽癌细胞株HONE1,采用荧光定量PCR法测定转染后HONE1细胞ENO1及内参GAPDH的mRNA表达,测定干扰效率,以筛选出最有效干扰序列。后将最有效的干扰片段转染至HONE1 NPC细胞。荧光定量PCR法检测ENO1在干扰前后mRNA的变化。以转染细胞系为样本,利用transwell小室实验检测ENO 1被沉默后HONE1细胞体外迁移运动能力的改变,利用Boyden小室实验检测ENO1沉默对NPC细胞的侵袭迁移能力的影响；MTT、流式细胞仪检测ENO1表达水平改变后对NPC细胞增殖、细胞周期分布、细胞凋亡和停泊非依赖性生长能力的影响。结果：1.鼻咽癌中ENO1表达特性的鉴定及临床意义（1）免疫组织化学检测ENO1蛋白在鼻咽癌组织中的表达：SP免疫组化结果表明,ENO1表达主要定位在鼻咽癌细胞胞浆中,阳性表达结果在镜下呈棕黄色。而在慢性鼻咽炎组织及肿瘤周围相对正常组织则为弱阳性或阴性表达。我们利用ENO1兔抗人多克隆抗体对1 20例鼻咽癌标本和40例正常鼻咽组织进行了免疫组化检测,ENO1的高表达率在鼻咽癌组织中为60.0%（72/120）,而在正常组织中为27.5%（11/40）（χ2=11.424,p=0.001,）。两组ENO1的表达具有显著性差异。而在对临床分期与淋巴结转移、远处转移的分析中,结果显示ENO1的表达与临床分期显著相关（χ2=13.919,P=0.003）。临床T4期组要低于临床T1-T3期组,即ENO1阳性表达者,多为临床早中期；ENO1阴性表达者转移发生率低,多为临床晚期。但ENO1蛋白蛋白表达与颈淋巴结转移及远处转移无关（P>0.05）。上述实验结果提示我们ENO1在鼻咽癌表达上调,且与转移及临床分期显著相关。但其表达上调对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响以及调控的具体机制仍不明确。2.ENO1表达沉默对鼻咽癌细胞CNE2生物学特性的影响（1）荧光定量PCR检测：ENO1在鼻咽癌细胞中的表达采用QPCR检测ENO1基因在鼻咽癌细胞株中的表达情况,结果单因素方差分析显示6种细胞株中ENO1的表达差异具有显著性（F=13.067,P=0.000）。其中筛选出HONE1为高表达ENO1的细胞株,作为下一步实验的干扰对象。（2）瞬时转染siRNA-ENO1-2片段入HONE1细胞系。采用MTT法检测ENO1基因沉默后细胞的体外增殖情况,结果显示,与HONE1-NC和HONE1细胞相比,HONE1-siENO1细胞的增殖速度显著减慢,并且呈时间依赖关系（F=4.764,P=0.001）。细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布,结果显示两组细胞的细胞周期分布并无显著性差异。综上所述,ENO1表达沉默显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。（3）瞬时转染siRNA-ENO1-2片段入HONE1细胞系。采用Transwell小室检测ENO1基因被沉默后HONE1细胞体外迁徙运动能力的变化,结果显示：结果发现两组细胞运动能力的差异具有显著性,（t=-3.163,P=0.004）。与空载体对照HONE-NC细胞相比,干扰ENO1后的HONE1细胞穿过膜的细胞数显著增加,其运动能力明显增强。Boyden小室检测ENO1基因沉默后HONE1细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示,两组细胞侵袭能力的差异具有显著性（t=-13.758,P=0.000）,与HONE1-NC细胞相比,HONE1-siENO1细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数增加,HONE1-siENO1细胞的侵袭能力显著增强。以上结果表明,ENO1基因沉默后显著提高了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。结论：1.较正常鼻咽组织,ENO1在鼻咽癌组织中表达明显上调,且与鼻咽癌的侵袭与转移密切相关；2.ENO1基因沉默后显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖,但促进了迁移和侵袭能力。ENO1与鼻咽癌的发生发展密切相关；

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 技术路线
• 第一章 鼻咽癌中ENO-1表达特性的鉴定
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 第二章 ENO-1基因沉默对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢
• 统计学证明