基于2D-HPTLC技术的野葛异黄酮类化合物的代谢谱初步研究

论文摘要

代谢组学在药用植物研究上的应用，不仅可以揭示药用植物中有效成分在植物体中的形成、转化及其相互关系的本质规律，阐明药用植物有效成分的形成机理。同时，也可通过研究不同生态环境下药用植物（生态型）的代谢产物，了解药用植物的区域性分布，应用于鉴别中药道地药材和指导药材栽培，这对于中药产业的发展将具有重要作用。代谢组分析技术多种多样，其中，高效薄层色谱（HPTLC）具有设备简单、操作简易、展开速度快、分离能力强、斑点清晰集中、展开剂组成多样、色谱图形象直观等特点，被广泛应用到化学合成、天然药物的定性鉴别和纯度检验中。一般情况下，一维薄层色谱即可达到很好的分离效果，但对成分复杂的混合物尤其是植物提取物，简单的一维薄层色谱还很难达到理想的分离效果，这就需要更复杂的分离技术，常采用的有二维薄层色谱技术等。葛根是一种传统中药，也是药、食两用的天然植物资源，前人已对葛根进行了深入研究，研究证明异黄酮类化合物是葛根的主要生物活性成分。迄今，经鉴定的葛根异黄酮类化合物已达到三十多种。同时，黄酮类化合物生物合成途径已十分明确，相关酶和基因均已得到分离和鉴定，因此，黄酮类化合物通常被选择为植物次生代谢生理研究的模式系统。本文以野葛和粉葛为试材，尝试初步建立基于2D-HPTLC分析技术的异黄酮类化合物代谢谱分析平台；并通过对不同产地、不同年限的野葛和粉葛样品中异黄酮类化合物的代谢谱分析，研究异黄酮类化合物的累积规律。该课题不仅研究了不同产地、不同年限的野葛和粉葛样品中异黄酮类化合物的累积规律，而且对丰富代谢组学研究技术方法都具有重要的意义。实验取得以下主要结果：比较了不同固定相、不同流动相的2D-HPTLC分离效果，筛选并确定了以聚酰胺为固定相，流动相体系：第一维为水：正丁醇：丙酮：1,4-二氧六环=70：15：10：5（v/v）；第二维为苯：甲醇：丁酮：水=55：25：23：2（v/v）的2D-HPTLC分离技术条件，实现了对野葛异黄酮类化合物的有效分析检测，并结合数据分析处理，初步建立起了异黄酮类化合物代谢谱分析方法。野葛和粉葛根样的2D-HPTLC分析结果表明，野葛和粉葛的共有成分含量有很大的差异，单位干重粉葛样品中异黄酮化合物含量远低于野葛异黄酮化合物的含量。生长年限对野葛异黄酮含量有很大影响，多数异黄酮类化合物组分随着生长年限的增长而含量减少，但有个别异黄酮组分含量增加。不同产地野葛样品的2D-HPTLC图谱有一定的相似性，但异黄酮含量有较大差异，其中，葛根素、3’-甲氧基葛根素和大豆苷的含量由高到低依次为九华山野葛、舒城3年生野葛、金寨3年生野葛、芜湖横岗野葛；而大豆甙元的含量由高到低依次为九华山野葛、金寨3年生野葛、舒城3年生野葛、芜湖横岗野葛。不同产地粉葛样品的2D-HPTLC图谱有一定的相似性，但异黄酮含量有一定的差异，其中，葛根素和大豆苷的含量依次为赣葛5号粉葛、江西吉安粉葛、宁国2号粉葛、芜湖南陵粉葛。从安徽舒城产野葛根样中共分离得到14个单体化合物，通过HPLC、NMR（包括氢谱和碳谱）和ESI-MS分析，已鉴定出它们的结构，分别为3’-甲氧基葛根素（化合物1）、大豆甙（化合物2）、芒柄花苷（化合物3）、染料木苷（化合物4）、印度黄檀苷（化合物5）、大豆苷元（化合物6）、葛根素（化合物7）、染料木素8-C-葡萄糖甙（化合物8）、芒柄花素8-C-芹菜糖基-（1-6）葡萄糖甙（化合物9）、4’,7-二羟基-8-C-β-呋喃葡萄糖基异黄酮（化合物10）、刺芒柄花素（化合物11）、4’,7-二甲氧基大豆苷元（化合物12）、（+）野葛醇B-2’’-O-葡萄糖甙（化合物13）和芒柄花素8-C-木糖基-（1-6）葡萄糖甙（化合物14）。其中化合物10、12为首次从该属植物中分离得到的已知化合物。从安徽舒城野葛的愈伤组织中分离得到的异黄酮化合物有：大豆甙（化合物2）、芒柄花苷（化合物3）、染料木苷（化合物4）、大豆苷元（化合物6）、葛根素（化合物7）和染料木素（化合物15）。由此可见：野葛根样与愈伤组织中异黄酮类化合物有着明显差异，根样中以葛根素、3’-甲氧基葛根素等苷类含量较高；而离体培养物中苷类以大豆甙、染料木苷，苷元类以染料木素、大豆甙元含量较高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 代谢组学概况
• 1.1.1 代谢组学的定义
• 1.1.2 代谢组学的研究层次
• 1.1.3 代谢组学与其他组学的区别和特点
• 1.1.4 代谢组学的研究方法
• 1.1.5 代谢组学研究中存在的问题及发展趋势
• 1.1.6 代谢组学在药用植物中的应用及黄酮类化合物的分析方法
• 1.2 葛根的研究进展
• 1.2.1 葛属植物的种属及分布
• 1.2.2 葛根的开发利用
• 1.2.3 葛根化学成分的研究进展
• 1.2.4 葛根的药理作用
• 2 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究内容和技术路线
• 2.2.1 研究内容
• 2.2.2 技术路线
• 2.3 课题来源
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 实验药品
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 2D-HPTLC技术平台的建立
• 3.4.2 2D-HPTLC代谢分析中差异斑点的定性分析
• 4 结果与分析
• 4.1 2D-HPTLC技术平台的建立
• 4.2 2D-HPTLC技术的野葛异黄酮的代谢谱分析
• 4.2.1 2D-HPTLC图谱的比较
• 4.2.2 不同产地和生长年限对葛根异黄酮含量的影响
• 4.3 2D-HPTLC代谢谱分析中差异斑点的定性分析
• 4.3.1 野葛总黄酮的提取
• 4.3.2 野葛根样总黄酮浸膏的分级萃取
• 4.3.3 柱层析法分离纯化
• 4.3.4 HPLC法检测分离得到的单体化合物纯度
• 4.3.5 分离的野葛单体化合物的结构鉴定
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录A 葛根中分离纯化的异黄酮单体化合物的NMR谱图
• 致谢
• 作者简介