环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定

论文摘要

环丙沙星（Crprofloxacin,CPFX）属于氟喹诺酮类广谱高效抗菌药物,是获美国FDA批准在美国上市的第二个喹诺酮类药物。对革兰氏阴性菌有很强的杀伤力,能够抑制细菌的DNA螺旋酶,抗菌谱广、低毒、组织穿透力强,被用于兽医临床和畜牧生产中,用来治疗动物疾病。但在实际应用中由于盲目及不合理应用,导致了耐药菌株的出现,并且在动物组织内的残留经食物链进入人体后,对人体具有潜在的致癌性,会对人体的健康造成威胁。许多国家已经对其休药期和在畜产品中的最高残留限量做出了限制。因此,环丙沙星在动物产品中的残留已成为一个必检项目。这就迫切需要建立一套快速检测残留的方法。本研究的目的是通过制备环丙沙星单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）,并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品中环丙沙星残留检测阻断ELISA试剂盒做技术支持,使之应用于动物性食品质量监测,从而保障动物性食品安全。本试验采用碳二亚胺法（EDC）将载体蛋白牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）和鸡卵白蛋白（Ovalbumin, OVA）分别与CPFX偶联合成免疫抗原CPFX-BSA和包被抗原CPFX-OVA,经紫外（UV）扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定,表明人工抗原偶联成功;用免疫抗原免疫BALB/c小鼠,免疫的5只小鼠血清抗体效价均达到了1:105左右,其中4号小鼠血清效价最高并且半数抑制浓度（50% inhibiting concentration,IC50）最低（17.21 ug/L）;通过细胞融合技术并且应用间接ELISA和阻断ELISA筛选分泌CPFX mAb的杂交瘤细胞株,细胞融合后筛选出1株敏感特异的杂交瘤细胞株,命名为3D2;采用体内诱生腹水法制备CPFX mAb,并对其染色体核型、效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。经鉴定,其细胞培养上清效价为1:1.28×103,腹水效价为1:1.6×105。其对CPFX的IC50为9.95 ug/L,对恩诺沙星的交叉反应率为128.39%,与其它同系的喹诺酮类抗生素的交叉反应率很低。本实验获得了高价、敏感、特异的抗CPFX mAb,为CPFX残留快速检测ELISA试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 喹诺酮类药物简介
• 1.1.1 结构和类型
• 1.1.2 理化性质
• 1.1.3 作用机理和临床应用
• 1.1.4 耐药性
• 1.2 环丙沙星药物概述
• 1.2.1 环丙沙星结构和性质
• 1.2.2 环丙沙星的作用机理和临床应用
• 1.2.3 环丙沙星的耐药性
• 1.2.4 环丙沙星的残留及危害
• 1.3 兽药残留的现状
• 1.3.1 兽药残留的种类
• 1.3.2 兽药残留的成因
• 1.3.3 兽药残留的危害
• 1.3.4 针对兽药残留应采取的对策
• 1.4 环丙沙星残留检测技术
• 1.4.1 生物测定法（MIA）
• 1.4.2 理化分离法
• 1.4.3 免疫学分析法（IA）
• 1.5 本课题的目的和意义
• 第二章 人工抗原的合成及环丙沙星多克隆抗体的制备
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 试验仪器与设备
• 2.1.3 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 人工抗原合成和鉴定
• 2.2.2 多克隆抗体的制备
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 人工抗原合成的鉴定
• 2.3.2 CPFX 多克隆抗体间接ELISA 效价测定
• 2.3.3 CPFX 多抗血清的敏感性鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 人工抗原的合成
• 2.4.2 完全抗原的鉴定
• 2.4.3 动物免疫方案的选择
• 2.5 小结
• 第三章 环丙沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 试验仪器与设备
• 3.1.3 实验细胞
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞融合备用小鼠的选择
• 3.2.2 SP2/0 骨髓瘤细胞的复苏和培养
• 3.2.3 脾细胞的制备
• 3.2.4 细胞融合
• 3.2.5 融合细胞的培养
• 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 SP2/0 细胞的培养
• 3.3.2 细胞融合
• 3.3.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆
• 3.4 讨论
• 3.4.1 细胞融合
• 3.4.2 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
• 3.5 小结
• 第四章 环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 试验动物
• 4.2 方法
• 4.2.1 单克隆抗体的生产
• 4.2.2 免疫学特性的鉴定
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 杂交瘤细胞核型分析
• 4.3.2 细胞上清和腹水效价测定
• 4.3.3 敏感性测定
• 4.3.4 特异性测定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 单克隆抗体的大量制备
• 4.4.2 抗体特异性
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介