论文摘要
研究背景胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。尽管近年来在手术、放疗、化疗等方面已取得很大进展,但其疗效仍不容乐观。其中恶性者（WHO分级Ⅳ级）被确诊后存活时间一般不超过一年。迄今为止,任何治疗措施,包括手术、放疗、化疗都不能从根本上改变这一致命肿瘤的自然转归,探索新的治疗方法因而显得十分必要和迫切。基因治疗为人们提供了一种新的治疗选择。其中又以“自杀基因”的应用尤为引人瞩目。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（herpes simplex virus-1 thymidinekinase,HSV1-TK）基因是目前研究及应用较多的一种自杀基因。该酶底物特异性不强,可催化核苷类似物如更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）、阿昔洛韦（Acyclovir,ACV）等的磷酸化,后者在细胞内酶的作用下,进一步成为有毒性的三磷酸化合物,阻碍DNA复制,最终导致细胞死亡。其中,与GCV组成的HSV1-TK/GCV治疗系统在国外已被用于临床试验。但该疗法在达到引起肿瘤退化时所需要的GCV剂量有引起免疫抑制及其他毒副作用的风险。而ACV尽管相对毒性低,但其与HSV1-TK间的低亲和力限制了其临床应用的可行性。因而目前不少学者试图通过构造HSV1-TK突变体来提高该自杀基因系统总体治疗效应以减少所需的GCV量,减少药物副作用。其中HSV1-sr39TK是目前研究比较热门的一种突变体。它是通过半随机序列诱变将HSV1-TK基因酶活性位点或邻近部位的7个碱基替换,造成5个氨基酸的改变,从而改变其对前体药物的转化能力。研究显示,其与GCV作用的米氏常数（Km）为野生型的十四分之一。体内体外实验证实,在目前所构造的几种增加前体药物亲和力的突变体中,HSV1-sr39TK/GCV系统的肿瘤杀伤作用最明显,对GCV最敏感。国内近一两年也有关于TK突变体对淋巴细胞作用的报道,但用于神经胶质瘤方面则未见报道。在HSV1-TK/GCV自杀基因系统治疗肿瘤过程中,研究者发现不仅转导了自杀基因的细胞（TK+细胞）可以在给予前药后被杀死,而且与其相邻的未转导自杀基因的细胞（TK-细胞）也可被杀死,这种现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。研究显示只要约10%的肿瘤细胞转染有HSV1-TK基因,即可达到治疗效果。但其机制目前尚未完全明了。有研究者认为细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）在其中扮演着重要角色,GCV的三磷酸代谢物通过间隙连接由TK+细胞传递到TK-细胞,是引起后者死亡的重要原因。本研究通过脂质体介导HSV1-TK基因和其突变体HSV1-sr39TK基因转染细胞,构建了表达HSV1-TK和HSV1-sr39TK基因的C6细胞,进而通过细胞和动物实验,比较评估了两者对肿瘤细胞的生长抑制和杀伤效应;同时采用GJIC的阻断剂18α-甘草次酸（18α-glycyrrhetinic acid,AGA）来观察自杀基因系统的旁观者效应是否会因间隙连接的阻断而被抑制,并对AGA干预前后的细胞进行间隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）表达的检测,探讨AGA对间隙连接的阻断是否通过抑制Cx43的表达而起作用。实验共分三个部分:第一部分HSV1-sr39TK基因修饰的鼠胶质瘤C6细胞的构建目的构建表达HSV1-TK或其突变体HSV1-sr39TK基因的C6细胞。方法1.利用T载体连接将HSV1-TK的cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建重组表达质粒pcDNA3-TK,和已有的pcDNA3-sr39TK表达质粒一起扩增并抽提纯化,Xho1和EcoR1双酶切鉴定,并送行测序。2.通过Effectene试剂将pcDNA3-TK和pcDNA3-sr39TK转染入C6细胞,所得转染后细胞分别命名为C6-TK和C6-sr39TK细胞。TRIzol法提取各组细胞的总RNA,两步法RT-PCR检测细胞中HSV1-TK或HSV1-sr39TK mRNA含量;同时用Western blotting及细胞免疫方法检测各组HSV1-TK或HSV1-sr39TK蛋白表达水平。结果1.成功获得pcDNA3-TK质粒,双酶切得到1128bp的目的基因片段。经测序鉴定,pcDNA3-TK酶切得到的1128bp片段序列,除一处无义突变外,和原始序列一致。而pcDNA3-sr39TK的双酶切,也得到1128bp的片段,测序显示和原始序列完全吻合,成功获得分别含HSV1-TK或HSV1-sr39TK的pcDNA3.1真核表达质粒。2.鼠C6胶质瘤细胞株经重组质粒转染48h后,RT-PCR和Western blotting检测表明C6-TK和C6-sr39TK组细胞均出现预期的特异性目的基因条带和内参照β-actin条带,而未转染组仅出现β-actin条带。半定量分析显示两个转染组间目的基因mRNA和蛋白表达水平均无统计学差异（P=0.058和P=0.095）。免疫细胞化学染色显示C6-TK和C6-sr39TK组细胞均有阳染细胞出现,其中,前组阳性细胞占（13.25±1.12）%,后组阳性细胞占（13.76±2.09）%,组间比较差异无统计学意义（x2=0.142,P=0.706）。对照组未见阳染细胞。结论本实验成功克隆和构建了分别表达HSV1-TK和其突变体HSV1-sr39TK基因的真核表达质粒pcDNA3-TK和pcDNA3-sr39TK,并通过脂质体介导,将构建的重组质粒成功转入鼠胶质瘤C6细胞,RT-PCR、Western Blotting和细胞免疫化学均证实目的基因在细胞中得到有效表达,且两个转染组目的基因的表达水平无明显统计学差异,为进一步的基因治疗研究奠定了基础。第二部分HSV1-sr39TK/GCV系统治疗胶质瘤的实验研究目的通过体内和体外实验比较HSV1-sr39TK/GCV和HSV1-TK/GCV自杀基因系统对胶质瘤细胞的杀伤效应。方法1.细胞实验:利用前期构建成功的分别表达HSV1-TK和HSV1-sr39TK基因的鼠胶质瘤C6细胞（C6-TK和C6-sr39TK）,通过MTT实验和Hoechst-PI染色比较HSV1-sr39TK/GCV和HSV1-TK/GCV自杀基因系统对C6细胞的体外杀伤效应。2.动物实验:20只裸鼠,两侧背部靠近后大腿根部皮下植瘤,其中左侧接种未转染细胞,右侧随机分为两组分别接种C6-TK和C6-sr39TK细胞。成瘤后腹腔注射GCV治疗,10d为一疗程。卡尺测量用药前后肿瘤体积大小,并利用micro-PET进行肿瘤18F-FDG代谢显像,比较活体肿瘤治疗效果。实验终点,杀鼠取瘤,进行常规病理检查,并采用RT-PCR、Western blotting及免疫组化等检测肿瘤组织中HSV1-TK或HSV1-sr39TK的表达情况。结果1.GCV作用24～48h后,C6-TK和C6-sr39TK细胞开始出现一系列形态学的改变,细胞生长抑制甚至死亡。GCV浓度越高,作用时间越长,这种变化越明显。而实验浓度的GCV未对未转染组细胞产生明显的影响。72h的MTT结果显示,GCV浓度在0～400μM时,C6-sr39TK细胞存活率由（99.96±3.54）%下降到（4.75±1.79）%:C6-TK细胞存活率从（100.03±2.95）%降至（59.16±3.48）%,未转染组细胞存活率则从（100.29±1.20）%到（83.62±7.56）%。同一GCV浓度时,各组间细胞存活率差异有统计学意义（P＜0.05）。2.Hoechst-PI染色显示,GCV作用72h后,未转染组绝大部分细胞被hoechst33342标记,细胞核呈均匀、朦胧蓝色,只有极少数细胞呈PI标记阳性。C6-TK和C6-sr39TK组PI阳性标记的死亡细胞明显较未转染组增多,PI阳性率分别为（31.529±0.019）%和（60.960±0.020）%,两组间比较有统计学差异（x2=35.765,P=0.000）;并在hoechst33342标记阳性的细胞中,出现染色质呈簇状、颗粒大小不一、蓝色高亮的凋亡细胞。3.各组细胞在活体均能致瘤,GCV治疗10d后,C6、C6-TK和C6-sr39TK组肿瘤大小分别为（1287.24±364.84）、（928.47±165.61）和（574.08±107.72）mm3,较治疗前均有一定程度的生长,但后两组生长较前组明显减缓,以C6-sr39TK组生长减缓最明显。组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。4.18F-FDG显像提示GCV干预前C6、C6-TK和C6-sr39TK各组动物肿瘤显影都很清晰,重建图象ROI法测定T/NT值各组依次分别为1.710±0.398、1.823±0.404、1.620±0.481,组间比较无明显统计学差异（F=0.150,P=0.861）。GCV治疗10d后,各组动物T/NT值分别为4.576±1.100、3.648±0.743和3.335±0.700,组间比较有统计学差异（F=7.006,P=0.003）。5.常规病理检查提示未转染组为典型的胶质瘤细胞,生长活跃,核分裂像明显。C6-TK和C6-sr39TK组肿瘤组织有大量坏死出血,伴有纤维组织增生。其中以C6-sr39TK组更明显。6.RT-PCR、Western blotting及免疫组化均证实实验终点时肿瘤组织中仍可检测到目的基因的表达。结论体外和体内实验证实HSV1-sr39tk比HSV1-tk对GCV更敏感,可提高其与GCV所组成的自杀基因系统对C6胶质瘤细胞的杀伤效应。在较低GCV浓度时即可对细胞产生明显的杀伤效应,降低了由于GCV剂量过大所引起的免疫抑制等风险,为自杀基因系统的优化和进一步的临床应用提供了依据。第三部分HSV1-TK/GCV系统“旁观者效应”机制探讨目的探讨GJIC在HSV1-TK/GCV自杀基因系统“旁观者效应”中的可能作用。方法采用GJIC的阻断剂AGA干预C6-TK细胞,通过MTT实验观察其对自杀基因系统的细胞杀伤效应的影响;借由RT-PCR、Western blotting及免疫组化检测AGA干预前后的间隙连接蛋白Cx43的表达水平的变化情况。结果在同一GCV浓度处理下,无AGA干预组的细胞存活率较干预组下降明显（P＜0.05）,差异有统计学意义（P＜0.05）。但AGA尚不能完全阻断旁观者效应。RT-PCR显示AGA的干预,可明显降低Cx43的mRNA相对表达量,结果有统计学差异（t=37.703,P=0.000）。Westernblotting的半定量分析显示AGA的干预有下调Cx43蛋白表达水平的趋势,但结果尚无统计学意义（t=2.102,P=0.069）。免疫细胞组化也未发现两组间Cx43阳染率的明显统计学差异（x2=0.197,P=0.658）。结论GJIC阻断剂AGA能明显减弱HSV1-TK/GCV系统的旁观者效应,证实GJIC在自杀基因系统的旁观者效应中扮演重要角色;而AGA对GJIC的阻断作用,可能部分通过减少Cx43的表达而起作用。C6细胞的旁观者效应可能还有其他机制参与。
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