草莓基因组中LTR反转录转座子的分离和鉴定

论文摘要

草莓是无性繁殖的蔷薇科草本植物,近年来国内草莓生产发展很快。随着植物组织培养技术在草莓上的广泛应用,生产中发现一些草莓微繁殖苗表现体细胞无性系变异现象。转座元件的激活是体细胞无性系变异的一个重要原因,本文首次从八倍体栽培草莓,二倍体、四倍体野生草莓基因组中分离了Ty1-copia组反转录转座子的RT基因序列;对来自不同倍性草莓的Ty1-copia组反转录转座子的RT基因序列,进行了系统进化分析;同时从八倍体栽培草莓基因组中分离了Ty3-gypsy组反转录转座子的RT基因序列并对八倍体草莓基因组中的Ty1-copia、Ty3-gypsy组反转录转座子的拷贝数和转录活性进行了分析。主要结果如下:1.采用PCR简并引物扩增的方法从八倍体栽培草莓基因组中分离出了19条独立的Ty1组反转录转座子RT序列,这些序列推测的氨基酸序列的异质性为1.15%～70%,其中含有终止密码子和移码现象的有5条,余下的14条具有潜在转座活性。基于这19条独立氨基酸序列的系统进化分析,将它们分为7组,其中第1组全部含有终止密码子序列。从二倍体野生草莓基因组中分离出34条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列,推测的氨基酸序列的异质性为2.3%～55.06%,其中含有终止密码子12条,余下的22条为有潜在转座活性的序列。将二倍体草莓中分离的34条独立序列进行系统进化分析,共分为7组,其中第7组全部含有终止密码子序列。从四倍体野生草莓基因组中分离出13条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列,推测的氨基酸序列的异质性为1.12%～55.06%,其中含有终止密码子2条,余下的11条为有潜在转座活性的序列。将四倍体草莓中分离的13条独立序列进行系统进化分析,共分为4组,其中第4组全部为含有终止密码子。2.在八倍体栽培草莓基因组中分离出了10条独立的Ty3-gypsy组反转录转座子RT基因序列,推测的氨基酸序列的异质性为1%～30%,其中含有终止密码子的2条,序列不完整的2条,余下的6条为有潜在转座活性的序列。将八倍体草莓中分离的10条独立Ty3-gyps组反转录转座子RT序列进行系统进化分析,共分为2组。3.通过对八倍体栽培草莓、二倍体野生草莓和四倍体野生草莓的Ty1-copiae组反转录转座子RT序列进行系统进化分析发现:二倍体绿色草莓（Fragaria viridis Duch）与四倍体东方草莓（Fragaria orientalis Lozinsk）的亲缘关系相对其它种近:来自森林草莓（Fragaria vesca Duch）的一条Ty1-copia组反转录转座子RT序列wd3-1是本研究所分离的各类草莓Ty1组反转录转座子序列中最古老的一条。4.采用Southeron斑点杂交估测出Ty1-copia和Ty3-gyps组反转录转座子在八倍体栽培草莓基因组中的拷贝数分别是2875,348。两种LTR类反转录转座子占整个八倍体栽培草莓基因组的15.8%,其中Ty1-copia组反转录转座子在基因组中的比例为13.5%,大于Ty3-gyps组的2.3%。5.通过RT-PCR技术检测不同处理对八倍体草莓中两种LTR反转录转座子转录活性的影响,结果显示:在常规大田植株和组织培养继代植株中都没有发现有转录活性的LTR类反转录转座子;在MS+6-BA 0.5mg·L-1+GA30.5mg·L-1+TDZ2.0 mg·L-1+IBA0.02mg·L-1和MS+6-BA 0.5 mg·L-1+GA30.5mg·L-1+TDZ 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.1mg·L-1两种再生培养基诱导的草莓愈伤组织中检测到有转录活性的Ty1-copia组反转录转座子;在分别用2 mM水杨酸、50 mM茉莉酮酸甲酯、50 mM脱落酸、50 mM 2,4-D,处理了16 h后的大田草莓叶片中,检测到Ty1-copia组反转录转座子转录活性。6.发生转录的22条独立的Ty1-copia组反转录转座子RT序列中,ys11-11,ys11-27和xp4-2与其它序列差别较大,其余的19条序列异质程度为1%～6.51%,明显低于从草莓基因组中分离的Ty1-copia组反转录转座子RT序列。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 LTR类反转录转座子的类型、结构特点和转座机制
• 1.1.1 LTR类反转录转座子的类型
• 1.1.2 LTR类反转录转座子的结构特点
• 1.1.3 LTR类反转录转座子的转座机制
• 1.2 LTR反转录转座子的特性
• 1.2.1 广泛存在于高等生物基因组中
• 1.2.2 高拷贝性
• 1.2.3 高异质性
• 1.2.4 垂直传递和水平传递
• 1.3 反转录转座子的活性及其对基因组的影响
• 1.3.1 反转录转座子的活性
• 1.3.2 反转录转座子的活性及其对基因组的影响
• 1.4 植物反转录转座子在功能基因组学中的应用
• 1.5 基于反转录转座子的分子标记类型及其应用
• 1.5.1 序列特异扩增多态性
• 1.5.2 反转录转座子位点间扩增多态性
• 1.5.3 反转录转座子微卫星扩增多态性
• 1.5.4 基于反转录转座子插入多态性
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 草莓基因组中LTR反转录转座子的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 草莓叶片总DNA的提取及检测
• 2.1.4 PCR反应
• 2.1.5 PCR特异DNA片段的回收
• 2.1.6 PCR产物克隆测序
• 2.1.7 序列比较与分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 草莓DNA的质量和完整性的检测
• 2.2.2 RT基因PCR扩增体系的优化
• 2.2.3 序列比对和系统进化分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 TyI组反转录转座子PCR扩增中的假阳性现象
• 2.3.2 LTR反转录转座子的异质性
• 2.3.3 草莓种间亲缘关系及进化
• 2.4 小结
• 第三章 草莓基因组中LTR反转录转座子的拷贝数及其在基因组中所占比例的分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 草莓基因组模板DNA的制备
• 3.1.3 草莓叶片总DNA的检测
• 3.1.4 DNA斑点印迹
• 3.1.5 DNA的交联
• 3.1.6 杂交探针的制备
• 3.1.7 Southern斑点杂交
• 3.1.8 洗膜
• 3.1.9 杂交信号的获得
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总DNA样品的质量、浓度和完整性检测
• 3.2.2 探针的制备
• 3.2.3 Southern斑点杂交结果与拷贝数的计算
• 3.3 讨论
• 3.3.1 用于印迹的总DNA质量
• 3.3.2 杂交信号强弱的分析
• 3.3.3 草莓基因组中存在高拷贝的Ty1组和Ty3组反转录转座子
• 3.4 小结
• 第四章 草莓基因组中LTR反转录转座子转录活性分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 愈伤组织的诱导
• 4.1.3 激素处理叶片
• 4.1.4 草莓叶片总RNA的提取及检测
• 4.1.5 RT-PCR
• 4.1.6 PCR产物特异DNA片段的回收
• 4.1.7 PCR产物克隆测序
• 4.1.8 序列比较与分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 RNA的质量和完整性的检测
• 4.2.2 RT-PCR对表达活性的检测
• 4.2.3 序列比对和系统进化分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 DNA污染对RT-PCR反应的影响
• 4.3.2 胁迫激活反转录转座子的转录活性
• 4.3.3 草莓中有转录活性的Ty1组反转录转座子RT序列的进化分析
• 4.4 小结
• 第五章 结论及创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 下一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间发表的文章
• 致谢