低温诱导条件下小麦返白系冷驯化相关基因的表达谱研究

论文摘要

小麦返白系是在研究小麦矮变1号时发现的自然突变体,是一个特殊的小麦遗传材料。其显著特点是突变体苗期表现与野生型无差异,随着温度降低,每年早春阶段,返白系自心叶基部开始,并随生长自下而上逐渐白化。之后,随着温度的逐渐升高,又自心叶基部开始复绿,呈现“返白--复绿”特性,前后历时约30-40天。该突变体返白特性受细胞核与细胞质基因共同调控,受低温诱导,温度升高可使白化逆转。到目前为止,类似这样的突变体材料在国内外报道的很少,因此小麦返白系及其返白机理的研究对于探索质体发育的分子机理、植物基因的表达调控以及核质互作等都具有重要的理论价值。近年来,已对小麦返白系的表现性状、遗传特性、叶绿体发育、及返白期间的色素、蛋白与核酸代谢等进行了研究。但至今,小麦返白系的返白机理还没有清楚的阐明。本研究以小麦返白系及其亲本矮变1号为材料,利用基因芯片和数字表达谱两种方法检测不同时间低温处理后冷驯化相关基因表达水平的差异,筛选表达有差异的基因;对基因芯片和数字表达谱筛选的候选差异表达基因再利用半定量PCR验证基因芯片和数字表达谱数据的准确性;根据半定量PCR的结果,利用实时定量PCR进一步验证基因芯片和数字表达谱的数据,进一步确定与返白系返白现象相关的基因。研究取得的主要结果如下:?1.基因芯片杂交数据显示:芯片上总探针位点是61290个,检测出约5%的基因在低温诱导后出现表达差异。在矮变中,低温处理5d的样品较没有低温处理的样品1522个上调基因,449个下调基因;低温处理30d的样品较没有低温处理的样品有2113个上调基因,849个下调基因;在返白系中,低温处理5d的样品较没有低温处理的样品有1197个上调基因,622个下调基因;低温处理30d的样品较没有低温处理的样品有1793个上调基因,1060个下调基因;没有低温处理返白系较没有低温处理的矮变有183个上调基因,109个下调基因。基因芯片中共筛选出18个在返白系与矮变1号材料间表达有明显差异的低温相关的差异基因,其中包括10个EST和8个功能基因,其中包括春化相关基因Ver2。2.数字表达谱结果分析表明:在对照材料矮变1号中,低温处理2d后的数字表达谱结果中检测到了11544个基因,低温处理20d的样品中检测到了10194个基因;在返白系小麦中低温处理2d的样品中检测到了11893个基因,低温处理20d的样品中检测到了10052个基因,合计共检测到了15327个基因。在冷驯化过程中上调表达的基因多于下调表达的基因,数字表达谱中Ver2基因在两个品种中的表达差异也很明显。3.基因芯片中共检测到了90个冷驯化相关基因;数字表达谱中共检测到51个冷驯化相关基因,基因芯片和数字表达谱共同检测到16个冷驯化相关基因。4.半定量PCR与实时定量PCR验证结果表明,Ver2基因、未知功能的两个EST序列（Genebank accession No. CA642397和CA718270）在返白系和矮变1号中的表达水平有明显差异。Ver2基因仅在小麦返白系中表达,在矮变1号中检测不到该基因;CA642397在返白系中表达量很低几乎不受低温影响,在矮变中随着低温处理时间的延长表达量逐渐降低,在低温处理1d和30d表达量出现峰值;CA718270在返白系中,常温和低温处理初期处于较低的表达水平,EST CA718270在常温和低温处理的初期表达量没有明显变化,低温处理5d和20d各有一个表达高峰,在矮变中,处于一个相对较低的表达水平,在低温处理1d和5d各有一个表达高峰。本研究的结果为小麦返白系返白机理最终阐明奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦返白系研究概况
• 1.1.1 关于白化
• 1.1.2 小麦返白系
• 1.1.3 返白期间的蛋白、氨基酸代谢的变化
• 1.1.4 返白期间的色素代谢变化
• 1.1.5 环境对小麦返白系表达效应的影响研究
• 1.1.6 返白系叶绿体超微结构变化
• 1.2 冷驯化相关基因的研究进展
• 1.2.1 小麦中的冷驯化相关基因
• 1.2.2 小麦中冷驯化过程中基因转录调控途径
• 1.3 春化作用
• 1.4 基因芯片技术概述
• 1.4.1 基因芯片发展简介
• 1.4.2 基因芯片原理
• 1.5 数字表达谱
• 1.5.1 数字表达谱的简介
• 1.5.2 数字表达谱的原理
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 实验技术路线
• 第二章 低温条件下小麦返白系及其亲本矮变1 号小麦叶片的基因芯片数据分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 常用的试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因芯片
• 2.2.2 材料的准备
• 2.2.3 小麦心叶总RNA 的抽提、纯化及检测
• 2.2.4 总RNA 的紫外定量和检测
• 2.2.5 总RNA 的电泳质检
• 2.2.6 基因芯片主要实验流程
• 2.2.7 表达差异基因的筛选
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 总 RNA 样品检测
• 2.3.2 不同低温处理时间的心叶基因的表达差异分析
• 2.3.3 低温胁迫下A 与F 心叶基因表达谱差异
• 2.3.4 基因芯片中检测到的冷驯化相关基因
• 2.3.5 基因芯片中检测到的材料间表达有差异的冷驯化相关基因
• 2.3.6 基因芯片中筛选出的差异表达基因
• 第三章 低温条件下小麦返白系及亲本矮变1 号的叶片基因数字表达谱数据分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 常用的试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 数字表达谱
• 3.2.2 材料的准备
• 3.2.3 小麦心叶总RNA 的抽提、纯化及检测
• 3.2.4 总RNA 的定量和质量检测
• 3.2.5 电泳质检
• 3.2.6 数字表达谱的主要实验流程
• 3.2.7 表达差异基因的筛选
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 总 RNA 样品检测
• 3.3.2 数字表达谱中检测到的基因
• 3.3.3 低温胁迫下A 与F 心叶基因表达谱差异
• 3.3.4 数字表达谱中检测到的冷驯化相关基因
• 3.3.5 数字表达谱中检测有显著差异的冷驯化相关基因
• 3.3.6 基因芯片和数字表达谱中结果的比较
• 第四章 表达差异基因的验证
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 常用的试剂及配置
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 材料的准备
• 4.2.2 小麦心叶总RNA 的抽提、纯化及检测
• 4.2.3 紫外定量和检测
• 4.2.4 电泳检测总 RNA
• 4.2.5 反转录总RNA
• 4.2.6 RT-PCR 引物设计
• 4.2.7 以β-actin 为内参，调整模板的量
• 4.2.8 半定量 PCR 分析
• 4.2.9 qRT-PCR 分析
• 4.2.10 小麦基因组DNA 的提取
• 4.2.11 Ve12 基因及其启动子引物设计
• 4.2.12 Ve12 基因相关研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 总 RNA 样品检测
• 4.3.2 半定量 PCR 验证基因的表达谱
• 4.3.3 qRT-PCR 验证基因芯片和数字表达谱
• 4.3.4 基因组 DNA 样品检测
• 4.3.5 返白系中 Ve12 基因的初步研究结果
• 第五章 讨论
• 5.1 取样时间点及取样部的选择
• 5.2 基因芯片中的数据分析
• 5.3 数字表达谱中的数据分析
• 5.4 基因芯片和数字表达谱共同检测到的冷驯化相关基因
• 5.5 基因芯片和数字表达谱数据的验证通过
• 第六章 结论与创新点
• 6.1 结论
• 6.2 本研究的主要创新点
• 6.3 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介