论文摘要
人巨细胞病毒是免疫功能低下宿主的重要病原体，也是宫内感染引起先天性畸形以及儿童多器官损伤的一个重要致病因子。当前的抗病毒药物不能完全清除人巨细胞病毒，长期、反复用药引发的药物毒副作用及不能忽视的耐药问题促使人们寻求一种更安全更有效的治疗方法。RNA干扰作为一种新型的基因阻断技术，因其高效性、强特异性、低毒性等优点，在抑制病毒的复制、表达等方面显示出了其强大的应用潜力。UL54基因编码HCMV的DNA多聚酶，为病毒复制所必需，它可作为HCMV感染基因治疗的靶基因。siRNA在RNAi过程中起着关键作用，因其识别的mRNA靶序列可能存在复杂的二级结构干扰siRNA的识别。因此，合理设计siRNA并筛选出理想的靶位是十分有必要的。在本研究中，我们利用pAVU6+27质粒，设计并构建6个shRNA表达载体（psiUL54-1～6），与融合蛋白表达载体pUL54S1／2-EGFP共转染AD293细胞，荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况，通过RT-PCR来分析UL54S1、UL54S2 mRNA水平的变化并利用流式细胞仪评价siRNA对融合蛋白的抑制作用，最终建立人巨细胞病毒UL54基因小干扰RNA靶位筛选体系。本研究分二部分：第一部分，融合蛋白表达质粒pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达；第二部分，人巨细胞病毒UL54基因小干扰RNA靶位筛选体系的建立。第一部分融合蛋白表达载体pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达方法：扩增人巨细胞病毒UL54基因967-1750及2308-3070位点的序列，分别命名为UL54S1（784bp）及UL54S2（763bp）。UL54S1、UL54S2用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后分别定向克隆入已行双酶切的质粒pEGFP-N1中，连接产物转化感受态细胞DH5α中，PCR法及双酶切法筛选阳性克隆，并进行测序验证。构建成功的融合蛋白表达质粒行脂质体法转染AD293细胞，转染后24h、48h通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达情况，运用流式细胞仪检测AD293细胞表达EGFP阳性细胞率和平均荧光强度。结果：1．PCR法及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切法筛选阳性克隆并进行测序，结果与GenBank登录的HCMV AD169株的UL54基因（gi：1487749）967-1750及2308-3070位点的DNA序列完全一致。2．质粒pEGFP-N1及融合蛋白表达质粒pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP转染AD293细胞24h、48h后均可在荧光显微镜下观察到增强型绿色荧光蛋白的表达，而空白对照组则无增强型绿色荧光蛋白的表达。3．流式细胞仪检测结果显示48h pEGFP-N1组平均转染率为38％，平均荧光强度为590；pUL54S1-EGFP组平均转染率为47％，平均荧光强度为547；pUL54S2-EGFP组平均转染率为56％，平均荧光强度为578。结论：成功构建融合蛋白表达质粒pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP，运用荧光显微镜可检测到增强型绿色荧光蛋白在AD293细胞中的表达。利用流式细胞仪可测定每孔细胞表达EGFP的阳性细胞率及平均荧光强度，达到对UL54S1、UL54S2基因的定量分析，为后续成功筛选出有效的siRNA靶位提供了依据。第二部分人巨细胞病毒UL54基因小干扰RNA靶位筛选体系的建立方法：利用siRNA在线设计工具选取6个siRNA靶位点，合成相应的shDNA模板。利用合成的shDNA模板及pAVU6+27质粒，构建6个shRNA表达载体，命名为psiUL54-1～6。shRNA表达载体与融合蛋白表达载体pUL54S1／2-EGFP共转染AD293细胞，荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况，通过RT-PCR分析UL54S1、UL54S2 mRNA水平的变化，并利用流式细胞仪评价siRNA对融合蛋白的抑制作用。结果：1．PCR法筛选shRNA表达载体阳性克隆，经测序，psiUL54-2～6序列与预期序列完全一致。2．荧光显微镜下观察质粒psiUL54-4～6与pUL54S2-EGFP共转染AD293细胞48h后细胞中荧光蛋白的表达无明显变化；质粒psiUL54-2与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞48h后荧光蛋白的表达无明显变化；质粒psiUL54-3与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞48h后可引起荧光蛋白的表达下降；3．RT-PCR结果显示质粒psiUL54-4～6与pUL54S2-EGFP共转染AD293细胞24h、48h后UL54S2 mRNA水平无明显变化；质粒psiUL54-2与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞24h、48h后UL54S1 mRNA水平无明显变化；质粒psiUL54-3与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞24h后UL54S1 mRNA水平无明显变化，转染48h后则可引起UL54S1 mRNA水平的下降。4．流式细胞仪检测结果进行统计分析发现质粒psiUL54-2与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞48h对融合蛋白UL54S1-EGFP的表达无影响（P＞0.05）；质粒psiUL54-3与pUL54S1-EGFP共转染AD293细胞48h对融合蛋白UL54S1-EGFP的表达有抑制作用（P＜0.01）；质粒psiUL54-4～6与pUL54S2-EGFP共转染AD293细胞48h后对融合蛋白UL54S2-EGFP的表达均无影响（P＞0.05）。结论：质粒psiUL54-3表达的siRNA能下调UL54S1基因mRNA水平，有效抑制融合蛋白UL54S1-EGFP的表达；UL54基因序列中1532-1550位点是有效的siRNA靶位点；成功建立载体法筛选人巨细胞病毒UL54基因小干扰RNA靶位的体系。
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