论文摘要
目的:晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products, AOPP）是Witko-Sarsat等人于1996年首次报道的由尿毒症血液透析患者血浆中分离出的蛋白交联产物,作为氧化应激（oxidative stress, OS）新的标志物,是有一定生物学活性的促炎症反应介质。AOPP作为尿毒症毒素分子参与慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）和透析患者临床一些并发症发生的病理生理过程。本研究旨在通过人工合成晚期氧化蛋白产物-人血清白蛋白（AOPP-HSA）模型诱导体外培养的人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells, HPMCs）对TGF-β1表达的影响及内源性活性氧（reactive oxygen species, ROS）在此过程中的调节机制,来探讨AOPP与维持性腹膜透析（continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD）相关腹膜纤维化之间的关系,从而为临床防治腹膜纤维化提供理论依据。方法:采用Witko-Sarsat等介绍的方法,分别按照摩尔比为1/12.5、1/25、1/50、1/100将无内毒素的人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）与次氯酸溶液反应,体外制备出四种不同氧化修饰程度的AOPP-HSA模型。从CAPD治疗的CKD患者腹膜透析流出液中分离并在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中原代培养人腹膜间皮细胞,第二代细胞应用免疫组化方法进行细胞鉴定,第三代细胞用于实验,分别按照不同的实验要求分成浓度依赖组、时间依赖组、药物干预组。采用ELISA法检测HPMCs上清液中TGF-β1蛋白水平,采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）半定量分析HPMCs中TGF-β1mRNA的基因表达水平,同时应用流式细胞仪检测细胞内对氧化剂敏感的2,7-二氢二氯荧光素（DCFH）发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内活性氧的生成水平。分别用不同浓度的抗氧化剂维生素E（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L）,和N-乙酰半胱胺酸（0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L）预处理细胞,观察抗氧化剂对HPMCs内源性ROS及TGF-β1表达的影响。结果:1. AOPP-HSA能显著诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,呈剂量依赖方式（P<0.01）,在0-48h内TGF-β1的分泌与基因表达随时间的延长而增多,呈正相关关系（P<0.05）,在48h达到高峰（P<0.01）,随后出现降低。并且也与HSA/HOCL摩尔比成正相关关系（P<0.01）。2. AOPP-HSA也明显增加腹膜间皮细胞ROS的生成量,呈剂量依赖方式（P<0.01）,在0、15、30min时间内平均荧光强度变化与时间呈依赖方式,在30min达到高峰（t=-26.073, P<0.01）,随后在60min、120min内逐渐下降（t=-20.607、-11.813, P均<0.05）。并且也与HSA/HOCL摩尔比成正相关关系（P<0.01）。3.分别用不同浓度的抗氧化剂维生素E （12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L）和N-乙酰半胱胺酸（0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L）预处理细胞,与PBS对照组相比,可明显地降低细胞内ROS的生成量,同时显著地抑制AOPP-HSA诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,呈剂量依赖方式（P<0.01）,其中维生素E （50μmol/L）组和NAC （10mmol/L）组抑制更加显著。4.未经HOCL修饰的HSA不能显著的诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达及增加细胞ROS的生成量,与PBS对照组比较,无显著的统计学差异（P>0.05）。结论:1.体外制备的AOPP-HSA可显著诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,部分可能通过内源性ROS介导细胞内信号转导途径调节此过程,提示AOPP可能通过增加体内氧化应激参与腹膜纤维化的形成过程。2.体外制备的AOPP-HSA可刺激人腹膜间皮细胞呼吸爆发,而抗氧化剂维生素E和N-乙酰半胱胺酸可显著降低细胞ROS的生成量。3.维生素E和N-乙酰半胱胺酸作为抗氧化剂通过清除细胞ROS而显著抑制TGF-β1的分泌与基因表达。4.此研究揭示抗氧化剂在防治腹膜纤维化发生、发展过程中可能是一种有效的药物,为抗氧化剂在临床上的应用提供可靠的理论依据。
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标签：晚期氧化蛋白产物论文; 腹膜间皮细胞论文; 转化生长因子论文; 腹膜透析论文;