论文摘要
马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）对集约化养猪业的发展危害严重,同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。类M蛋白是该菌一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗的吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验构建了类M蛋白基因（szp）的缺失株,在分子水平上对马链球菌兽疫亚种类M蛋白的粘附机制进行了研究,同时,通过动物模型评价了该突变株的毒力和免疫原性。因此本研究所构建的ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变弱毒菌株,为该菌的致病机制及引起的猪链球菌病的防控进行了有益的探索。1链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因缺失株的构建根据已发表的马链球菌兽疫亚种猪源ATCC35246株的类M蛋白基因序列,设计和合成一对基因步移引物,并以ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过基因步移技术,扩增出类M蛋白左右两翼基因。为了敲除类M蛋白基因,以ATCC35246为始发菌株,构建基因重组质粒PUC-18,利用同源重组的原理构建了ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株（缺失了类M蛋白基因共1090bp）并对该菌株的致病力、小鼠模型的免疫保护作用进行了研究。结果表明,ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株对实验小鼠的致病性明显减弱;突变株能对小鼠提供良好的免疫保护,半定量RT-PCR显示,免疫鼠IL-2、IFN-γ基因的转录水平显著升高。所以经免疫的小鼠可以获得良好的被动免疫保护作用。为了进一步确定szp基因的具体作用,进行了马链球菌兽疫亚种szp基因缺失株的基因互补实验。实验证实基因互补株与野生株的生物特性基本一致。因此本研究所构建的ATCC35246的szp基因缺失突变弱毒菌株可作为预防ATCC35246感染的疫苗候选株,为最终研究制出马链球菌兽疫亚种链球菌的基因工程菌苗奠定基础。2类M蛋白及其基因缺失株对HEp-2细胞的粘附作用采用通用的模式细胞HEp-2细胞,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的粘附作用。结果显示,用重组的ATCC35246株类M蛋白预处理HEp-2细胞,当类M蛋白的量达到3.2μg/200μL,可显示为阳性;用重组表达的类M蛋白单抗处理类M蛋白,可抑制其对HEp-2细胞的粘附,在1.8μg/500μL能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附,说明其单抗对应的抗原表位在细胞粘附中具有决定性作用。同时发现,亲本株及szp基因缺失株均对HEp-2细胞有黏附和侵袭力,但szp基因缺失株黏附能力降低50%以上。电镜观察结果显示,黏附部位是细胞膜和细胞微绒毛,并观察链球菌内化现象。以上结果提示,上皮细胞是SEZ的定植细胞;菌株黏附后直接侵入细胞内是其穿过上皮细胞屏障的机制之一。