鹅垂体特异性转录因子（PIT-1）基因启动子的克隆及调控区的初步鉴定

论文摘要

垂体特异性转录因子1（PIT-1）是重要的组织特异性转录因子,也是调控垂体内GH、PRL、TSH-β转录的重要反式作用因子,对动物早期的发育和相关基因表达调控起重要的作用,认为是与生长相关和作为研究动物生长机制的重要候选基因之一。但目前在畜禽上,该基因研究还不够深入,尤其是对该基因的转录调控水平的研究,本研究以鹅为实验对象,成功地克隆了PIT-1基因启动子区序列,并对该区域从转录调控方面进行初步研究。1.鹅PIT-1基因启动子区域克隆及序列分析本实验利用基因组步移技术,首次从鹅基因组中克隆到了共约3.0kb的PIT-1基因5’启动子区序列,序列已提交到Genbank（序列号：EU924269）。利用在线软件对所得结果进行了序列分析和物种间PIT-1基因5’启动子区序列比对和系统进化树构建。结果表明所克隆的片段中含有两段启动子,分别命名为近端和远端启动子,且都含有典型的TATA框和CAAT框,还预测到一些转录元件,如1nyogenin, TFIID, GATA-1, AP-1, GR, HOXD10, TCF-4E, PRA, Sp1, POU1Fla, POU3F2, GATA-4, Foxj2等。序列比对结果表明,不同物种PIT-1基因的同源序列主要集中在转录起始点上游-200bp至-1000bp区域。转录起始点上游-200bp区域保守性比较强,很可能为核心启动子序列,且鹅与鸡的同源性最高。同时,本实验使用Vista中的MLAGAN程序构建的系统进化树,结果反映了不同物种间进化关系。2.启动子区功能的鉴定和转录调控的研究利用基因组步移获得了鹅PIT-1基因的启动子区序列,采用了系列缺失法成功构建了一系列启动子缺失突变体（-2995/-1bp,-1485/-1bp,-1293/-1bp,-1014/-1bp,-775/-1bp,-561/-1bp,-353/-1bp,-206/-1bp）,使用构建荧光素酶报告基因载体和瞬时转染分析法进行启动子区活性的检测和转录调控的初步研究,与阴性对照对比发现不同区段均具有启动子活性,系列启动子缺失突变体的启动活性之间还存在不同,-561/-1bp片段得活性最强,可以初步推断此段可以作为该基因的核心启动子区,也可以认为该区域（-353/-1bp--561/-1bp）含有调控基因表达的顺式作用元件,如TFIID, HOXD10, Sp1, POU1F1a, POU3F2,此结果为今后进一步研究其转录调控机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第1章 文献综述
• 1 PIT-1基因的研究背景
• 2 真核基因转录调控的研究策略
• 2.1 核心启动子
• 2.2 近端启动子元件
• 2.3 上游启动子元件
• 2.4 真核生物基因调控的反式作用因子
• 2.5 启动子克隆方法的研究进展
• 3 启动子结构和功能
• 3.1 启动子结构分析方法
• 3.2 启动子DNA与转录因子相互作用的研究方法
• 4 本研究的目的和意义
• 第2章 鹅PIT-1基因启动子区域克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 PIT-1基因启动子区的克隆
• 2.2 克隆片段的序列特征分析
• 2.3 不同物种间PIT-1基因5’启动子区序列比对和进化树构建
• 3 讨论
• 第3章 鹅PIT-1基因启动子区转录调控区的初步鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 系列缺失体PCR扩增、酶切鉴定结果
• 2.2 鹅PIT-1基因启动子重组质粒的活性测定和分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢