青岛文昌鱼肌酸激酶基因的克隆、表达分析和功能研究

论文摘要

肌酸激酶（creatine kinase, CK）是磷酸原激酶家族的一员,它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。在从古老的海绵到脊椎动物的很多物种中被鉴定。在脊椎动物,当机体组织病变或受到感染时,体内CK活性迅速升高,但是在文昌鱼中对于此类蛋白功能却了解甚少。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文从青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri）cDNA文库中,分离出具有完整编码框的CK基因（BbCK）,并对其结构、进化、表达和功能进行了研究。首先,从文昌鱼cDNA文库中克隆到全长为1787 bp的BbCK cDNA,其最大开放阅读框编码379个氨基酸的蛋白质（理论分子量为43kDa）,无信号肽。该cDNA编码的蛋白（BbCK）同脊椎动物的CK一样,具有两个结构域:ATP: guanido phosphotransferase N-末端结构域和ATP: guanido phosphotransferase C-末端结构域,其活性部位位于C-末端结构域中,且都具有保守的CPSNLGT的序列。将BbCK同其他CK蛋白进行序列比对和系统进化分析发现,CK同功酶家族极为保守,BbCK与其他物种的Mi-CK聚为一类。其次,我们还研究了CK基因在文昌鱼中的表达情况。切片原位杂交分析表明,BbCK在成体组织中广泛表达,在肝盲囊和后肠中的表达量较高。再者,对BbCK的功能进行初步分析,发现细菌内毒素LPS处理文昌鱼后, BbCK基因表达水平迅速升高。因此,推测文昌鱼CK可能是一种急性时相蛋白,参与宿主免疫防御。为了进一步验证BbCK的免疫功能,我们构建原核表达载体,导入E.coli诱导表达。BbCK在包涵体中大量表达;经透析复性后,纯化出重组蛋白BbCK。用荧光标记重组蛋白与细菌作用,发现它能够与革兰氏阴性细菌大肠杆菌结合;并且作了抗菌活性的检测,发现复性后重组蛋白BbCK对革兰氏阴性细菌大肠杆菌有一定的抑制作用,从另一个侧面证明BbCK可能参与宿主的免疫防御。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 前言
• 1.1 文昌鱼概况
• 1.2 文昌鱼在比较基因组学中的重要性
• 1.3 文昌鱼免疫学方面研究进展
• 2. 肌酸激酶蛋白的研究进展
• 2.1 磷酸原激酶概述
• 2.2 肌酸激酶
• 3. 本文的研究目的以及采用的技术路线
• 3.1 研究目的
• 3.2 技术路线
• 第二章 青岛文昌鱼肌酸激酶基因的克隆、表达分析和功能研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 文昌鱼creatine kinase 基因全长cDNA 序列的克隆
• 2.2 序列与系统进化分析
• 2.3 切片原位杂交分析BbCK 基因在成体文昌鱼组织中的表达
• 2.4 文昌鱼BbCK 基因功能的初步探讨
• 2.5 重组蛋白pET32a/BbCK 的原核表达
• 2.6 复性后重组蛋白BbCK 的酶活力测定
• 2.7 荧光标记复性后重组CK 与细菌结合实验
• 2.8 复性后重组蛋白抑菌活性的检测
• 3 结果
• 3.1 BbCK 基因全长cDNA 序列的克隆
• 3.2 序列与系统进化分析
• 3.3 切片原位杂交技术分析BbCK 基因在成体组织中的表达
• 3.4 文昌鱼BbCK 基因功能的初步探讨
• 3.5 重组蛋白原核表达
• 3.6 复性后重组蛋白BbCK 的酶活力测定
• 3.7 荧光标记复性后蛋白与细菌结合
• 3.8 抑菌活性的检测
• 4 讨论
• 4.1 文昌鱼BbCK 基因的克隆和鉴定
• 4.2 文昌鱼BbCK 基因的保守性和进化分析
• 4.3 文昌鱼BbCK 基因功能研究
• 5. 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• （一） pET32a 表达载体物理图谱
• （二） 缩略语
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文