海藻糖合成酶基因转化玉米

论文摘要

干旱是玉米生产的主要限制因素。通过品种改良提高玉米品种耐旱能力,是克服干旱危害最为经济有效的方法。然而,玉米的耐旱性为微效多基因控制的数量性状,遗传改良比较困难,多年来进展不大。转基因技术可以打破物种间生殖隔离,转化利用其他物种有益基因。国内外曾用SOD、DREB等多种抗逆耐旱基因转化玉米,试图提高其耐旱性,但因这些基因耐旱能力不够强,耐旱机制与玉米生理代谢不协调等原因,转基因后代的耐旱性不能达到玉米生产要求。探索利用耐旱能力更高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因,是转基因耐旱玉米培育的技术关键。利用海藻糖的抗逆耐旱特性,采用基因工程将其相关酶的基因转入玉米等作物,进而培育抗旱耐盐新品种,这对于植物遗传改良具有重要意义。本研究按Adams介绍的方法提取啤酒酵母AS.1416菌株基因组DNA。依据PCR引物设计原则,采用Premier 5.0软件设计引物,用于扩增酵母基因组DNA上的TPS1片段。该引物在扩增出的TPS1片段两端引入新的酶切位点BamHⅠ和ApaⅠ。琼脂糖凝胶电泳回收扩增的TPS1片段并插入到T载体pMD19-T Vector中,命名为pT-TPS1。单子叶植物表达载体pC1300UbiDREB含有玉米泛素启动子ubiquitin、由植物组成型3.5S启动子启动的选择标记基因Hyg和大肠杆菌选择标记基因Kan。用限制性内切酶BamHⅠ和ApaⅠ分别消化pC1300UbiDREB质粒和包含TPS1基因的pT-TPS1质粒,琼脂糖凝胶电泳分别回收大片段和小片段,经T4-DNA连接酶连接后,组成单子叶植物表达载体pC1300UbiTPS1。根据载体pC1300UbiTPS1多酶切位点,用限制性内切酶BamHⅠ和ApaⅠ消化pC1300UbiTPS1,琼脂糖凝胶电泳显示长1603和11700 bp的两条特异带,分别是TPS1和pC1300UbiTPS1质粒骨架的长度。由此说明,TPS1基因插入到载体pC1300UbiTPS1中。农杆菌介导法转化“18-599R”和“18-599W”玉米胚性愈伤组织,两轮潮霉素梯度筛选后,得到“18-599R”和“18-599W”抗性愈伤组织各340和607块。愈伤组织的转化率分别为6.4%和10.2%,两者之间没有显著性差异。但是,“18-599R”愈伤组织的再生能力明显高于“18-599W”。抗性愈伤组织分化培养分别得到再生植株54和31株。PCR检测获得1个阳性植株。研究发现以继代后7-9d的愈伤组织侵染,其抗性愈伤的获得率最高。在共培养时添加400 mg/L半胱氨酸有助于获得稳定的转化水平,半胱氨酸作为一种抗氧化抑制剂有助于T-DNA转移到胚性愈伤组织中去。农杆菌菌液浓度为OD600=0.5,侵染时间为10 min时,杀菌比较容易,愈伤组织褐化率较低,是最适合的侵染浓度和时间。共培养时间以3 d为最佳。PCR检测阳性的植株,还有待进一步作分子杂交和表达检测,以及后代的分子标记选择和耐旱性鉴定,培育成稳定的转基因株系。除探索转化利用外源海藻糖合成酶基因,提高玉米耐旱性的可能性外,也有助于研究海藻糖代谢的有关机理。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 前言
• 1.1 干旱与抗旱
• 1.1.1 植物对水分胁迫的感知与信号传递
• 1.1.2 植物抗旱的生理、生化机制
• 1.2 海藻糖概况
• 1.2.1 海藻糖的理化性质
• 1.2.2 海藻糖对生物的保护作用
• 1.2.3 海藻糖的抗逆分子机理
• 1.2.4 海藻糖的应用前景
• 1.2.5 海藻糖合成酶基因遗传转化的研究进展
• 1.3 玉米遗传转化研究进展
• 1.3.1 玉米转化受体系统的研究
• 1.3.2 玉米遗传转化方法的研究
• 1.3.3 基因枪法和农杆菌介导法的比较
• 1.4 本研究的方法和目的
• 第二部分 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌、质粒和引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素和激素
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建
• 2.2.2 玉米胚性愈伤组织受体系统的建立
• 2.2.3 农杆菌浸染玉米愈伤组织
• 2.2.4 抗性愈伤组织的筛选和植株再生
• 2.2.5 再生植株的PCR检测
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 载体构建结果
• 3.1.1 pT-TPS1质粒
• 3.1.2 单子叶植物表达载体pC1300UbiTPS1
• 3.2 影响受体系统建立的因素
• 3.2.1 影响胚性愈伤组织诱导的因素
• 3.2.2 脯氨酸和甘露醇对胚性愈伤组织生长的影响
• 3.2.3 培养时间和温度的影响
• 3.3 影响农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化的因素
• 3.3.1 继代次数和转化前继代的天数的影响
• 3.3.2 半胱氨酸对转化的影响
• 3.3.3 农杆菌浓度和侵染时间的影响
• 3.3.4 共培养时间的影响
• 3.4 抗性愈伤率、再生率和转化率
• 第四部分 讨论
• 4.1 农杆菌介导的玉米遗传转化的发展趋势
• 4.2 抗逆基因工程的前景
• 4.3 海藻糖合成酶基因转化的前景
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 硕士期间发表的学术论文