薹菜品质分析及种质资源的亲缘关系研究

论文摘要

以十字花科蔬菜中的薹菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino var. tai-tsai Hort）为试材,以硫代葡萄糖苷为核心,对硫代葡萄糖苷的合成底物氨基酸、降解产物挥发性的芳香物质进行了详细的探讨,进一步明确了影响硫代葡萄糖苷和芳香物质合成和降解的因素,同时针对氨基酸合成硫代葡萄糖苷过程中的一个关键基因进行了克隆和表达。利用RAPD、ISSR标记技术对搜集的薹菜资源进行了归类整理。具体的研究结果如下：1.薹菜的营养成分评价通过对4个薹菜品种氨基酸组成、含量的分析,明确了薹菜氨基酸的种类和组成特点：谷氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低；氨基酸构成以脂肪族氨基酸为主,芳香族氨基酸和吲哚族氨基酸比例相对较低；根据WHO/FAO提出的标准,补充蛋氨酸+半胱氨酸组合的含量,则可提高薹菜的营养价值。通过对白菜类蔬菜8个品种的营养成分进行比较,可以看出薹菜的各种氨基酸含量总体趋势是高于小白菜和大白菜,而可溶性蛋白和Vc含量介于小白菜和大白菜之间,可溶性糖含量最低。为进一步开展薹菜品质研究和种质利用提供依据。2.薹菜中的硫代葡萄糖苷的鉴定与含量分析采用HPLC的方法,以‘京研薹菜’、‘南京小叶薹菜’、‘花叶薹菜’和‘小叶薹菜’4个品种为试材,在相同的栽培管理条件下对不同品种、不同食用部位（叶片、叶柄）以及不同的生长季节（春季和秋季）薹菜中的硫苷含量和成分进行了研究。4个品种中均含有8种硫苷成分,分别为2-羟基-3-丁烯基硫苷、3-丁烯基硫苷、4-羟基-3-吲哚基甲基硫苷、4-戊烯基硫苷、2-苯基乙基硫苷、吲哚-3-甲基硫苷、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷。各品种叶片中的硫苷含量显著高于叶柄；秋季栽培薹菜的硫苷含量高于春季；品种之间所含硫苷成分虽然相同,但含量差异较大。3.薹菜的风味物质分析利用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用分析技术研究品种、栽培季节对薹菜风味物质成分的影响,为十字花科蔬菜风味物质的进一步研究提供依据。试验中对春、秋两个季节栽培的3个薹菜品种风味物质成分进行分析。共检测鉴定出了腈类、酯类、醛类、酮类、醇类等11类化合物。不同品种之间风味物质差别较大；秋季栽培薹菜的风味物质数量高于春季。其中（E）-2-丁烯酸二乙酯、1-丁烯基-4-异硫氰酸酯、2,4-已二烯-1-醇、3-己烯-1-醇、（E,E）-2,4-己二烯醛、2-己烯醛、3-戊烯腈、苯丙腈和2-苯乙基异硫氰酸是薹菜中的含量较高的物质。品种、栽培季节均对薹菜的风味物质成分有影响。4.薹菜的cyp79B5基因的克隆和原核表达以薹菜品种‘京研薹菜’叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜cyp79B5基因全序列1847bp,包含有1620bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。以薹菜基因组DNA为模板,获得了2112bp的目的片段。经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等编码的氨基酸序列具有较高同源性,特别是与油菜cyp79B5基因编码的氨基酸序列同源性达到了100%,初步证明它是cyp79B5基因的序列全长。经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWiSS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。扩增cyp79B5完整的编码区序列,构建pET-24a （+）重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）, IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在64.1kD处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。5.薹菜种质资源的RAPD分析利用RAPD标记对29份薹菜资源进行了DNA多态性分析。首先对薹菜RAPD标记的反应条件进行了优化,筛选出了适合薹菜RAPD反应的最优条件。并从273条引物中筛选的33个RAPD引物共扩增出了336条清晰的谱带,其中293条显示多态性,平均每个引物扩增出10.2条多态性谱带,多态性比率为87.2%,说明薹菜的遗传多样性丰富。利用RAPD标记构建了29份薹菜资源的聚类树状图,距离系数为0.63-0.79,说明薹菜品种间的差异较小。通过RAPD分子标记技术明确了现有薹菜种质资源的亲缘关系,为薹菜的种质资源保护和利用奠定了基础。6.薹菜种质资源的ISSR分析利用ISSR标记对29份薹菜资源进行了DNA多态性分析。首先对薹菜ISSR标记的反应条件进行了优化,获得了最佳的反应条件,并从100条引物中筛选出的46条ISSR引物扩增出了522条清晰的谱带,其中414条显示多态性,平均每个引物扩增出9.0条多态性谱带,多态性比率为79.3%,说明薹菜的遗传多样性丰富。利用ISSR标记构建了29份薹菜种质资源的聚类树状图,距离系数为0.70-0.86（ISSR）,说明薹菜品种间的差异较小。通过ISSR分子标记技术明确了现有薹菜种质资源的亲缘关系,为薹菜的种质资源保护和利用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 薹菜的概述
• 1.1 薹菜的起源及分类地位
• 1.2 薹菜的植物学特征及分类
• 1.3 薹菜对环境条件的要求
• 1.4 薹菜的营养价值
• 2 硫代葡萄糖苷的研究进展
• 2.1 硫代葡萄糖苷的核心结构
• 2.2 十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷的种类和含量
• 2.3 硫代葡萄糖苷的合成和降解
• 2.4 硫代葡萄糖苷的检测方法
• 2.5 硫代葡萄糖苷的生物功能
• 2.6 影响硫代葡萄糖苷存在的因素
• 3 挥发性成分的研究进展
• 3.1 风味物质的合成及调控
• 3.2 风味物质的影响因素
• 3.3 蔬菜挥发性成分检测方法的探讨
• 3.4 前景与展望
• 4 CYP79家族基因研究进展
• 5 植物的遗传标记技术
• 5.1 RAPD标记技术的原理及在蔬菜作物遗传多样性中的应用
• 5.2 ISSR标记技术的原理及在蔬菜作物遗传多样性中的应用
• 参考文献
• 第二章 薹菜的营养成分评价
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 薹菜的氨基酸含量
• 2.2 薹菜的氨基酸构成
• 2.3 薹菜的必需氨基酸评价
• 2.4 薹菜与白菜类蔬菜氨基酸含量的比较
• 2.5 薹菜与其他白菜类蔬菜的营养成分含量比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 薹菜中硫代葡萄糖苷的鉴定与含量分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 硫苷的提取
• 1.3 HPLC分析
• 2 结果与分析
• 2.1 叶柄中硫苷成分的鉴定与分析
• 2.2 叶片中硫苷成分的鉴定与分析
• 2.3 叶片和叶柄中硫苷成分的比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 薹菜的风味物质分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 薹菜风味物质构成
• 2.2 薹菜主要风味物质组成及变化特点
• 2.3 春、秋两季薹菜风味物质比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 5基因的克隆及原核表达'>第五章 薹菜cyp79B₅基因的克隆及原核表达
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 5基因的原核表达'>1.3 薹菜cyp79B₅基因的原核表达
• 2 结果与分析
• 5在薹菜基因组DNA、cDNA中的扩增'>2.1 CYP75B₅在薹菜基因组DNA、cDNA中的扩增
• 5基因的序列分析'>2.2 薹菜CYP79B₅基因的序列分析
• 5基因在大肠杆菌中的表达'>2.3 薹菜CYP79B₅基因在大肠杆菌中的表达
• 2.4 融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 薹菜种质资源RAPD分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 薹菜基因组DNA的质量及产率
• 2.2 RAPD反应条件的优化
• 2.3 薹菜遗传多样性的RAPD分析
• 3 讨论
• 3.1 薹菜的遗传多样性
• 3.2 RAPD标记技术在薹菜上的应用
• 参考文献
• 第七章 薹菜种质资源ISSR分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 薹菜基因组DNA的质量及产率
• 2.2 ISSR反应体系的正交试验设计的直观分析
• 2.3 薹菜遗传多样性的ISSR分析
• 3 讨论
• 3.1 薹菜的亲缘关系分析
• 3.2 ISSR标记技术在薹菜上的应用
• 参考文献
• 全文讨论
• 1 薹菜的营养价值评价
• 2 薹菜中硫代葡萄糖普的鉴定和分析
• 3 薹菜中风味物质的鉴定和分析
• 5基因的克隆与原核表达'>4 CPY79 B₅基因的克隆与原核表达
• 5 薹菜的种质资源多样性
• 参考文献
• 全文结论
• 本文创新点
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢