腺病毒介导重组人生长激素基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究

论文摘要

人生长激素（ human growth hormone,hGH ）是由脑垂体前叶合成分泌的一种非糖基化、单链多肽类激素,由191个氨基酸组成。hGH的主要生理功能是促进人体生长发育和维持组织器官的正常功能。常用于治疗儿童生长激素缺乏症,除此之外,hGH还被用于烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松以及过渡肥胖等疾病的辅助治疗。由于其用途广泛,市场需求量很大。过去临床应用的hGH只能从人脑垂体中提取,来源十分困难且价格昂贵。现在大多采用基因工程的方法生产。利用基因工程技术来生产药物蛋白是目前的研究热点。如何经济、高效的生产这类蛋白也一直是人们努力探索的问题。目前,虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因植物、转基因动物等几种外源蛋白表达系统,但他们均存在着各种缺陷。动物乳腺已被证明为生产基因工程药物的理想场所,从乳汁中纯化分离出目的蛋白的方法相对简单。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产外源蛋白,本研究选取hGH作为目标蛋白,通过腺病毒介导使hGH蛋白在兔和羊乳腺中高效表达,并在兔和羊乳汁中获得目标蛋白。从而为腺病毒介导外源基因在动物乳腺中高效表达重组药用蛋白方法的进一步开发和生产提供技术和理论依据。本研究主要包括以下内容:（1）提取人脑垂体组织基因组,通过PCR扩增,获得用于表达的hGH DNA基因。并对其进行测序分析,测序结果与已发表的相应序列进行比对,确定所扩增的DNA的正确性。（2）真核表达载体的构建及其外源基因在真核细胞中的表达,证实插入表达载体中的hGH基因可用于表达;检测重组蛋白的生物活性。（3）同源重组法在细菌内构建重组腺病毒载体;（4）重组腺病毒载体在HEK293细胞中的包装及重组腺病毒的扩增;（5）重组腺病毒中的外源基因在培养的乳腺上皮细胞中的表达;（6）将重组腺病毒注射到兔和羊乳腺感染乳腺上皮细胞,分别检测兔和羊乳汁中重组hGH蛋白的表达。试验主要结果如下:（1）通过PCR法从人脑垂体组织基因组中获得了hGH基因。经DNA测序分析,所得hGH DNA序列与Genbank中的相应序列一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和p3GFP为基础质粒,构建了含有hGH基因的真核表达载体p3GF。p3GF载体中含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对目标蛋白基因的表达进行实时观测。（3）通过表达载体在CHO细胞株中的表达,证实了所构建载体在哺乳动物细胞中表达的可能性。通过对Jurkat细胞增殖试验证明细胞表达的重组hGH蛋白与hGH标准品具有相同的免疫学活性。（4）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hGH基因的穿梭表达载体pSGF,该载体中含有GFP报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行确定,提高了检测目标蛋白基因表达的效率,为hGH的表达研究奠定了基础。（5）将所构建并经鉴定正确的pSGF载体用Pme I酶切线性化,将线性化的pSGF直接转化处于感受态且含有Adeasy质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了重组AdGF腺病毒载体。验证了“两步转化法”可大幅度提高细菌内同源重组制备腺病毒载体的效率。（6）在培养的HEK293细胞中,进行了AdGF重组腺病毒的包装与扩增。通过重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达研究,证实了重组腺病毒可感染乳腺上皮细胞并且表达目标蛋白。（7）通过对兔和羊乳腺的感染试验,高效表达了具有生物活性的重组hGH蛋白,在兔乳腺中的最高表达量为0.780 mg/mL,通过用EGTA处理病毒,在羊乳腺中重组hGH蛋白最高表达量达到2.35 mg/mL。从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。本研究利用腺病毒为载体在兔和羊乳腺中高效表达了重组hGH。表明通过优化腺病毒载体的构建可促进动物乳腺成熟表达外源基因的蛋白。重组hGH的高效表达说明以腺病毒为载体,利用动物乳腺进行外源蛋白的生产是可行的。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用范围,无论在转基因技术理论领域还是在基因工程药物生产研究方面均具有重要意义,为转基因蛋白药物的生产开辟了一条新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 腺病毒载体研究进展
• 1.1.1 腺病毒基本生物学特性
• 1.1.2 重组腺病毒载体
• 1.1.3 腺病毒载体的应用
• 1.1.4 腺病毒载体研究展望
• 1.2 动物乳腺反应器生产重组蛋白的研究
• 1.2.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的研究概况
• 1.2.2 动物乳腺生物反应器存在的问题及发展前景
• 1.3 人生长激素的研究进展
• 1.3.1 人生长激素的基本结构
• 1.3.2 人生长激素的分泌与调节
• 1.3.3 人生长激素的生理作用
• 1.3.4 重组人生长激素在临床上的应用
• 1.3.5 重组人生长激素的研究状况
• 第二章 人生长激素基因的克隆及真核表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 人脑垂体基因组的提取与hGH DNA 的扩增
• 2.2.2 hGH DNA 序列分析
• 2.2.3 真核表达载体的构建
• 2.3 讨论
• 2.3.1 人生长激素基因组基因的利用
• 2.3.2 有关表达载体的构建
• 2.3.3 绿色荧光报告基因的选择
• 2.4 小结
• 第三章 人生长激素基因在真核细胞中表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 去除表达载体原核序列
• 3.2.2 CHO 细胞对G418 的抗性试验
• 3.2.3 重组质粒转染CHO 细胞
• 3.2.4 RT-PCR 检测mRNA 的表达
• 3.2.5 重组hGH 蛋白表达检测
• 3.2.6 ELISA 检测重组hGH 表达含量
• 3.2.7 重组hGH 的活性检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于表达载体原核序列
• 3.3.2 利用IRES 将两种蛋白耦联表达
• 3.3.3 关于外源基因导入方法
• 3.4 小结
• 第四章 同源重组法制备人生长激素腺病毒载体
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 腺病毒载体构建方法
• 4.3.2 有关同源重组法构建重组腺病毒载体
• 4.3.3 有关腺病毒载体的转化
• 4.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率
• 4.4 小结
• 第五章 重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 重组腺病毒在HEK293 细胞中的包装
• 5.2.2 重组腺病毒的纯化和滴度测定
• 5.2.3 体外感染RME 细胞试验
• 5.3 讨论
• 5.3.1 关于重组腺病毒在乳腺上皮细胞中的表达
• 5.3.2 腺病毒的感染机制
• 5.3.3 腺病毒生产中的几个重要环节
• 5.4 小结
• 第六章 重组腺病毒在兔和羊乳腺中高效表达的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 重组蛋白在乳腺中表达检测
• 6.2.2 乳腺中重组蛋白表达量检测
• 6.3 讨论
• 6.3.1 关于动物乳腺生物反应器
• 6.3.2 关于重组蛋白表达量
• 6.4 小结
• 结论及创新点
• 参考文献
• 缩略词和中英文对照表
• 致谢
• 作者简介