大鼠肾移植术后肾小球的比较蛋白组学研究

论文摘要

目的:利用蛋白质组学技术分析大鼠同系移植组和同种异基因移植组肾移植术后肾小球蛋白质组差异表达情况,寻找移植肾急性排斥反应相关的蛋白标志物。方法:1.建立大鼠肾移植模型:改良Fisher等建立的经典大鼠肾移植模型方法,进行大鼠腹腔原位肾移植手术;2.实验动物分组:（1）同系移植组（10只）:供、受者均为雄性Sprague-Dawely （SD）大鼠;（2）同种异基因移植组（10只）:供者为雄性SD大鼠,受者为雄性Wistar大鼠。实验大鼠于造模后第3d（每组5只）和第5d（每组5只）麻醉后取移植肾脏,移植肾标本分为两部分,一部分作病理学检测;另一部分用来分离肾小球进行比较蛋白组学研究;3.移植肾脏病理学检测:采用国际公认的Banff标准对移植肾脏排斥反应病理学改变程度进行分级评分;4.同系移植组和同种异基因移植组肾小球差异表达蛋白的鉴定:采用2-DE联合MS技术路线分离、鉴定移植肾急性排斥反应相关蛋白,即利用固相pH梯度（Immobilized pH gradient, IPG）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis, 2-DE）分离大鼠肾移植术后3d的肾小球蛋白,考马斯亮蓝染色后经PDQuest7.0软件进行图像分析识别差异表达的蛋白质点,将增强表达的10个蛋白质点进行胶内酶切后,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）分析获得差异表达蛋白的肽指纹图谱,并用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索、分析确定差异表达的蛋白;5.选2种差异表达的蛋白进行组织定位验证:采用免疫组织化学方法对差异表达的蛋白的分布和表达量进行初步验证,并分析与相同时间点（3d、5d）肾移植急性排斥反应病理学改变的相关性;6.血清中该可溶性差异表达蛋白的检测:采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法进行检测。结果:1.成功建立大鼠腹腔原位肾移植模型,供肾与受体鼠动静脉吻合时间40±10min,总手术时间110±20min。2.移植肾脏病理学改变:同系移植组术后第3d,肾小球、肾小管结构、形态基本正常,偶有散在的间质炎性细胞浸润;术后第5d,炎性细胞浸润数量未见增多,范围未见明显扩大;同种异基因移植组术后第3d,肾小球旁及小动脉周淋巴细胞浸润,肾小管间质散在淋巴细胞浸润,肾小球细胞数增多;术后第5d,肾小球内炎性细胞沿球囊向球内浸润,小动脉内皮细胞脱落、出血、血栓形成,亦可见小动脉壁纤维素样坏死,肾间质弥漫性炎细胞浸润,肾小管细胞变性、坏死;3.同系移植组和同种异基因移植组肾小球差异表达蛋白的鉴定结果:（1）得到了分辨率较高、重复性较好的同系移植组和同种异基因移植组的术后第3d的肾小球蛋白双向凝胶电泳图谱（17cm IPG胶条pH 3-10）;（2）比较分析同系移植组和同种异基因移植组移植后肾小球双向凝胶电泳图谱,找到差异蛋白质点24个（6个点表达降低,18个点表达增高）;（3）对其中10个差异蛋白质点进行了肽指纹图谱（Peptide mass fingerprint, PMF）分析,获得了8个差异表达蛋白的肽指纹图谱;经生物信息学方法分析确定了5种差异（增强）表达的蛋白:电压依赖性阴离子通道,3-磷酸甘油醛脱氢酶,Cofilin,CD44和热休克蛋白90（Heat shock protein 90, HSP90）。4.CD44和热休克蛋白90（Heat shock protein 90, HSP90）在移植肾组织的表达:免疫组织化学染色结果显示,同系移植组未见血管内皮表达CD44,移植肾皮质仅包曼氏囊壁层上皮细胞、肾小管及其间质少量表达CD44分子,同种异基因移植组移植肾皮质和髓质的肾小球、小血管内皮、肾小管和间质均高表达CD44分子;同系移植组移植肾组织肾小管和肾小球毛细血管内皮细胞微弱表达HSP90;同种异基因移植组移植肾小血管内皮细胞、肾小球强烈表达HSP90,且表达量与移植肾组织病理学损害程度相关;5.血清CD44和HSP90水平:ELISA结果显示同种异基因移植组术后第3d和第5d的血清CD44和HSP90水平较同系移植组明显升高（P<0.05）,同种异基因移植组术后第5d组血清CD44水平虽高于第3d组,但差异不显著（P>0.05）;同种异基因移植组术后第5d组血清HSP90水平明显高于3d组（P<0.05）。结论:发现大鼠肾移植急性排斥时肾小球差异表达的蛋白点有24个,其中6个点表达降低18个点表达增高,经肽指纹图谱鉴定和Mascot软件在NCBInr数据库中分析后确定了5种肾移植急性排斥反应相关蛋白,从中选出的CD44和HSP90经免疫组织化学方法验证在急性排斥反应早期（术后第3d）即可高表达于肾小球,且HSP90表达量与肾移植排斥反应病理损害程度相关,同种异基因移植组血清CD44和HSP90水平也较同系移植组明显升高,因此,初步确定CD44和HSP90为肾移植急性排斥反应的候选标志蛋白。本实验结果为CD44和HSP90作为监测指标用于肾移植急性排斥反应的诊断研究提供了理论和实验依据。

论文目录

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• 研究论文 大鼠肾移植术后肾小球的比较蛋白组学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历