小麦籽粒多酚氧化酶生化特性及其控制基因的研究

论文摘要

多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase,PPO）是引起亚洲面条和其它面制食品酶促褐变的主要因素,发生褐变的食品是不受消费者欢迎的,所以如何选育低PPO活性品种是育种家们非常感兴趣的问题,而小麦籽粒PPO活性如何被快速、准确地检测,PPO的生化特性以及控制基因与活性的关系是育种家们急需解决的问题。本文选用24个小麦品种初步探讨了以邻苯二酚代替L-DOPA,按照AACC 22-85的程序检测小麦籽粒PPO活性的可能性,并选用196份小麦品种作了进一步验证;选用3个代表性品种,初步分析了小麦PPO的酶学特性;选用19、54个PPO活性差异较大的品种,分别分析了籽粒发育、萌发过程中同工酶的变化;分析了11种化学试剂在5种浓度下对100个小麦品种籽粒PPO活性的抑制和激活效应;对43条EST和7条mRNA进行了序列组装;采用2A和2D染色体上STS标记分别检测了300个F4单株和362份小麦品种的PPO等位基因变异,并分析了等位基因2AL（2A染色体上低PPO活性基因）、2AH（2A染色体上高PPO活性基因）、2DL（2D染色体上低PPO活性基因）、2DH（2D染色体上高PPO活性基因）及等位基因组成类型与籽粒PPO活性的关系,初步探讨了内含子变异对PPO活性的影响,并提出了内含子参与PPO基因表达调控的可能性。通过以上试验,得出以下结论:1.以邻苯二酚代替L-DOPA,按照AACC 22-85的程序检测小麦籽粒PPO活性,是一个成本较低、准确可靠的小麦籽粒PPO活性检测方法。2.小麦PPO的最适反应温度为65℃,最适pH值为4.0～4.6,Km=0.19mol/L,Vmax=4.04×102mol/min。3.干种子中没有检测到同工酶。同工酶的数目在种子萌发过程中和灌浆期逐渐增加,而在从乳熟期到完熟期间逐渐减少。籽粒在吸水12h后PPO活性迅速升高,24h时达到峰值,然后逐渐趋向平缓。4.巯基乙醇、EDTA、饱和NaCl和SDS、亚硫酸氢钠、铜试剂、谷胱甘肽和维生素C对小麦PPO产生抑制效应,CuCl2产生激活效应。抑制剂和激活剂浓度与小麦PPO活性之间呈对数关系,小麦PPO的抑制和激活效应也受添加剂种类和基因型的影响。5.小麦中至少存在15种PPO基因,这些基因可分为3大类。第Ⅰ类为组织特异表达基因,与组织阶段发育生理功能有关;第Ⅱ类为种子储藏基因,参与完成种子萌发过程中某项生理功能;第Ⅲ类为抗耐性基因,亦可称为防御基因,在外界因素诱导下表达。6.约50%的籽粒PPO活性变异是由2A、2D染色体上等位基因变异提供的,2A染色体上等位基因变异对籽粒PPO活性的影响是2D染色体等位变异的2-3倍。7.大多数品种籽粒PPO活性处于中低水平。四种基因型2AL/2DL、2AL/2DH、2AH/2DL、2AH/2DH的籽粒PPO活性逐渐升高一个档次（40-60AU/min·g）,且其活性分别处于低偏中、中等、中偏高、高偏中水平,可分别使活性降低30.1%、降低7.8%、升高8.3%、升高30.0%。8.2AL和2DL基因分别使籽粒PPO活性降低25%和10%。2AH和2DH基因均可使籽粒PPO活性增加17%左右。2AL、2DL、2AH、2DH基因分别使籽粒PPO活性维持在低、中等、中高、中高水平。因此,在低PPO活性小麦育种中,应注重对2AL基因的选择。9.DQ889708可能是位于2B染色体上控制籽粒高PPO活性的主效基因片段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 多酚氧化酶的种类
• 2 多酚氧化酶的分布和定位
• 3 多酚氧化酶生理生化功能的研究
• 4 多酚氧化酶的遗传及分子生物学研究
• 4.1 PPO分子特征及分子量
• 4.2 PPO是多基因家族
• 4.3 PPO基因的克隆
• 4.4 PPO基因的诱导和表达
• 4.5 小麦PPO遗传及分子生物学研究
• 5 多酚氧化酶酶促反应动力学特性
• 6 小麦多酚氧化酶活性测定方法
• 7 本研究的意义和拟解决的问题
• 第二章 PPO活性检测方法
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 三种方法的可重复性分析
• 2.2 三种方法的方差分析
• 2.3 三种方法所测PPO活性的相关分析
• 2.4 方法三的验证
• 2.5 单因素试验结果分析
• 2.6 正交试验结果分析
• 2.7 高低PPO活性种质资源
• 3 讨论与结论
• 第三章 小麦PPO酶学特性
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦PPO反应进程曲线
• 2.2 pH对小麦PPO的影响
• 2.3 温度对小麦PPO活性的影响
• 2.4 PPO酶促动力学常数Km值的测定
• 3 讨论
• 第四章 同工酶与小麦PPO活性的关系
• 第一节 小麦籽粒发育过程中多酚氧化酶同工酶的变化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 同工酶谱
• 2.2 籽粒不同发育时期的同工酶谱
• 2.3 不同品种在相同发育时间的同工酶谱
• 3 讨论
• 第二节 小麦籽粒萌发过程中PPO活性变化及同工酶电泳分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 410nm值品种数分布'>2.1 籽粒萌发过程中PPO最大OD_410nm值品种数分布
• 2.2 小麦籽粒萌发过程中PPO活性变化趋势
• 2.3 萌发过程中PPO同工酶分析
• 2.4 同工酶与活性的关系
• 3 讨论
• 第五章 小麦PPO抑制和激活效应
• 第一节 小麦PPO抑制和激活效应的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 铜试剂对小麦PPO的抑制效应
• 2.1.1 抑制倍数与抑制百分率
• 2.1.2 铜试剂浓度与小麦PPO活性的关系
• 2对小麦PPO的激活效应'>2.2 CuCl₂对小麦PPO的激活效应
• 2.2.1 激活倍数与激活百分率
• 2浓度与小麦PPO活性的关系'>2.2.2 CuCl₂浓度与小麦PPO活性的关系
• 2.3 环境对抑制和激活效应的影响
• 2.4 基因型和试剂浓度对抑制和激活效应的影响
• 2.5 相对活力百分数
• 3 小结
• 第二节 酶活抑制剂对小麦PPO活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 抑制剂对多酚氧化酶活性的抑制效应
• 2.1.1 饱和NaCl对全麦粉中PPO活性的抑制效应
• 2.1.2 SDS对全麦粉中PPO活性的抑制效应
• 2.1.3 巯基乙醇对全麦粉中PPO活性的抑制效应
• 2.1.4 EDTA对全麦粉中PPO活性的抑制效应
• 2.1.5 相同浓度下抑制剂对全麦粉中PPO活性的抑制效应
• 2.2 PPO相对活力百分数
• 2.2.1 相对活力百分数的计算
• 2.2.2 不同抑制剂作用下PPO的相对活力百分数
• 3 讨论
• 第三节 不同添加剂对小麦PPO的抑制和激活效应
• 1.材料与方法
• 1.1 材料和设备
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 添加剂对小麦PPO的抑制和激活效应
• 2.1.1 抑制（激活）倍数与抑制（激活）百分率
• 2.1.2 添加剂对小麦PPO活性的影响
• 2.2 添加剂浓度对抑制和激活效应的影响
• 2.3 基因型对抑制和激活效应的影响
• 3 小结
• 第六章 小麦PPO基因电子克隆及其基因家族
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 电子克隆
• 1.2.2 PPO活性检测
• 1.2.3 等位基因鉴定
• 1.2.4 测序
• 1.2.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦PPO基因的电子克隆
• 2.1.1 AY596269、BQ236162、BQ239083和BT009357的序列组装
• 2.1.2 UniGene Ta8559 8个序列的组装
• 2.1.3 UniGene Ta50709 10个序列的组装
• 2.1.4 UniGene Ta8559和Ta50709 18个序列的组装
• 2.1.5 UniGene Ta31016序列的组装
• 2.1.6 7条mRNA和43条EST序列的组装
• 2.2 小麦PPO多基因家族
• 2.2.1 电子克隆的基因与其它PPO序列的比较
• 2.2.2 内含子变异对PPO活性的影响
• 2.2.3 控制基因与籽粒PPO活性的关系
• 2.2.3.1 等位变异与籽粒PPO活性的关系
• 2.2.3.2 基因型对籽粒PPO活性的影响
• 2.2.3.3 单个基因对籽粒PPO活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 EST序列与新基因的发现
• 3.2 小麦PPO基因的分类
• 3.3 决定PPO活性的因素
• 3.4 PPO基因的结构
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文