论文摘要
为综合利用白杨派树种生长迅速、材质优良和胡杨派树种抗盐碱的特性,本研究以白杨派树种毛新杨（P. tomentosa×P. bolleana）、银毛杨（P. alba×P. tomentosa）、银腺杨（P. alba×P. glandulosa）等为主要研究对象,选择耐盐木本植物胡杨（P. euphratica Oliv.）为外源DNA供体,就白杨花粉管通道法导入胡杨外源DNA技术进行系统研究,为通过花粉管通道法选育耐盐白杨杂种无性系打下一定的理论与技术基础。主要研究结果如下:（1）针对胡杨远距离取样问题,开展了胡杨叶片非低温取样保存方法研究,证明硅胶干燥和SDS DNA提取液均可以将胡杨叶片保存20d以上;考虑在花粉管通道导入中胡杨DNA的用量较大,宜选用冬季采取枝条水培出的鲜叶或硅胶干燥保存10d内的叶片;此时,采用DNA提取率相对较高的SDS方法,并添加2%β-巯基乙醇抑制DNA褐化,可以保证获得大量高质量胡杨DNA。（2）通过对不同发育状态的雌花序定期授粉观察表明,杨树雌蕊柱头可授性及最佳可授期与柱头形态存在一定关联性。当雌蕊柱头发育至最佳可授期时,毛新杨雌花序柱头外露明显,柱头4裂且夹角约为180°;银腺杨雌花序苞片张开,柱头外露且发亮,柱头4裂片开裂角度180°;银毛杨花序苞片张开,柱头外露,柱头4裂成60°～90°。在最佳授粉期授粉并以此为参照点进行处理,保证导入时机准确。参考作物育种经验,以毛新杨、银腺杨和银毛杨等为受体进行胡杨外源DNA花粉管通道导入处理时,毛新杨、银腺杨的有效处理时期在授粉后36～72h之间;银毛杨的有效处理时期在授粉后36～60h之间。而从施加花粉管通道导入外源DNA处理的实际结果看,授粉后30h开始处理即可获得转化株。（3）以毛新杨、银毛杨、银腺杨雌株为母本,毛白杨和新疆杨雄株为父本,就白杨花粉管通道导入胡杨DNA以及与秋水仙碱诱导胚囊染色体加倍联合处理等技术条件进行了研究。各处理组合共收获14721粒种子,大田存苗883株;施加花粉管通道导入胡杨外源DNA处理导致花序的平均结实率降低,其原因可能是由于授粉雌花序切柱头时造成的机械损伤影响,或者外源DNA处理液中残存的微量有机试剂的毒害作用;从获得的杂种后代表型变异看,大多倾向于父本或母本,只发现2株倾向于胡杨披针形叶的特异植株;在采用花粉管通道导入与染色体加倍联合处理获得的杂种后代中未检出三倍体或四倍体。（4）对白杨花粉管通道导入胡杨DNA的部分杂种后代进行AFLP分子标记检测,在授粉后24～54h开始处理、持续处理2～18h的杂种后代中,经AFLP分析检出了70株分子水平存在变异的株系,包括具A型新谱带（仅在处理后代中存在而在父本、母本、对照和供体胡杨中不存在的条带）的62株,具B型新谱带（仅在处理后代和供体胡杨中存在而在父本、母本、对照中不存在的条带）的8株。2株叶形特异植株在目前的分子检测中未发现变异。进一步对几组具有AFLP特异带的杂种后代和胡杨供体进行DNA同源序列比对分析,发现AFLP检测技术存在“假阳性”现象,表明花粉管通道导入外源基因组DNA研究只根据分子标记谱带特异性鉴别转化体并不准确。经杂种后代和胡杨供体进行DNA同源序列比对分析,以及对处理后代、供体、父母本和对照SCAR标记分析,以毛新杨为母本的杂种无性系中检测出1株外源胡杨DNA部分片段整合的杂种后代（MM10-2）,推测其整合机理为同源重组。
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摘要Abstract缩略词1 引言2 植物基因工程育种2.1 植物遗传转化的途径与技术方法2.1.1 农杆菌介导转化法2.1.2 基因枪转化法2.1.3 电击转化法2.1.4 PEG 介导法2.1.5 花粉管通道导入法2.1.6 植物花粉管通道导入外源DNA 技术的机理2.1.7 植物花粉管通道导入外源DNA 技术体系2.1.7.1 花粉管通道导入具体操作方式和适宜的导入时间2.1.7.2 花粉管通道导入的DNA 类型2.1.7.3 花粉管通道导入后代的检测手段2.2 花粉管通道导入外源DNA 技术的优势与存在问题2.3 花粉管通道导入外源DNA 技术在林木育种中应用展望3 基本研究思路4 材料与方法4.1 研究材料4.2 主要试剂及仪器4.2.1 主要试剂4.2.2 主要仪器4.3 研究方法4.3.1 用于DNA 提取的胡杨叶片非低温保存方法研究4.3.2 白杨可授性与最佳授粉时期的确定4.3.3 人工授粉杂交4.3.4 白杨花粉管通道导入外源胡杨DNA4.3.5 胡杨外源DNA 花粉管通道介导与胚囊染色体加倍联合处理4.3.6 种子收取、播种育苗方法4.3.7 体细胞染色体观察4.3.8 白杨转化后代AFLP 分子检测4.3.8.1 待测样品DNA 的准备4.3.8.2 模板DNA 的酶切、连接4.3.8.3 DNA 片段的预扩增4.3.8.4 DNA 片段的选择扩增4.3.8.5 胶的制备4.3.8.6 选择扩增产物电泳4.3.8.7 选择性扩增产物的银染显色4.3.8.8 扩增谱带记录4.3.9 特异DNA 片段的序列比较与分析4.3.9.1 特异带DNA 回收与纯化4.3.9.2 特异带DNA 片段与质粒载体的连接4.3.9.3 重组质粒的转化4.3.9.4 重组质粒的检测4.3.9.5 处理后代及供体特异DNA 片段序列测定与分析4.3.9.6 处理后代及供体特异DNA 片段SCAR 标记5 结果与分析5.1 胡杨叶片非低温保存方法与DNA 提取研究5.1.1 胡杨叶片DNA 提取体系建立5.1.2 胡杨叶片非低温保存方法5.1.3 小结5.2 白杨外源DNA 花粉管通道导入时机5.2.1 白杨外源DNA 花粉管通道导入的适宜时机5.2.2 白杨杂交可授性与最佳授粉时机的确定5.2.2.1 毛新杨雌花序最佳授粉期检测5.2.2.2 银毛杨雌花序最佳授粉期检测5.2.2.3 银腺杨雌花序最佳授粉期检测5.2.3 小结5.3 白杨花粉管通道导入外源胡杨DNA 技术研究5.3.1 毛新杨花粉管通道导入胡杨DNA 技术研究5.3.2 银毛杨花粉管通道导入外源胡杨DNA 技术研究5.3.3 银腺杨花粉管通道导入外源胡杨DNA 技术研究5.3.4 外源DNA 花粉管通道导入与胚囊染色体加倍联合育种5.3.4.1 毛新杨花粉管通道导入外源 DNA 与胚囊染色体加倍联合育种技术研究5.3.4.2 银毛杨花粉管通道导入外源 DNA 与胚囊染色体加倍联合育种技术研究5.3.4.3 银腺杨外源 DNA 花粉管通道导入与胚囊染色体加倍联合育种技术研究5.3.5 小结5.4 胡杨DNA 花粉管通道导入白杨杂种后代的AFLP 检测5.4.1 胡杨DNA 花粉管通道导入毛新杨杂种后代AFLP 检测5.4.1.1 胡杨DNA 花粉管通道导入 T804×TL50 杂种后代的 AFLP 检测5.4.1.2 胡杨DNA 花粉管通道导入T805×M1 杂种后代的AFLP 检测5.4.1.3 胡杨DNA 花粉管通道导入T805×XJ1 杂种后代的AFLP 检测5.4.1.4 胡杨DNA 花粉管通道导入T803×XJC 杂种后代的AFLP 检测5.4.2 胡杨DNA 花粉管通道导入银毛杨杂种后代AFLP 检测5.4.3 小结5.5 白杨花粉管通道导入胡杨DNA 供体特异片段序列分析5.5.1 变异体MM10-2 与供体特异DNA 片段的序列比较5.5.2 变异体MM10-2 特异DNA 片段的SCAR 标记5.5.3 AFLP 分析中的“假阳性”现象5.5.4 小结6 讨论（1） 用于 DNA 提取的胡杨叶片非低温取样与保存方法问题（2） 白杨花粉管通道导入外源 DNA 时机及其参照基点的确定问题（3） 白杨花粉管通道导入胡杨 DNA 育种的结实率与存苗率问题（4） 外源 DNA 花粉管通道导入与染色体加倍联合育种问题（5） 外源 DNA 花粉管通道导入白杨杂种后代表型变异问题（6） 胡杨外源 DNA 花粉管通道导入白杨杂种后代的分子检测判别问题（7） AFLP 标记技术用于外源基因组 DNA 转化体鉴定的可靠性问题（8） 胡杨外源基因组 DNA 花粉管通道导入白杨杂种的整合机理问题7 结论参考文献附图个人简介导师简介致谢
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