转基因乳酸杆菌联合5-氨基水杨酸对实验性结肠炎小鼠肠道炎症及免疫调节影响的研究

论文摘要

背景与目的炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）是一组病因不明的慢性、易复发性肠道炎症疾病,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）和克罗恩病（Crohn’s Disease, CD）,本病在我国近20年的发病率呈上升趋势。乳酸杆菌在促进肠道菌群平衡,调节肠粘膜免疫功能和增强肠粘膜屏障、防御病原方面起着重要作用。白细胞介素-10（IL-10）又名细胞因子合成抑制因子,是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子,在炎症性肠病的发展中起着重要的作用,同时在诱导型Treg细胞的诱导和CD4+ CD25+调节性T细胞的长期生存、抑制机制的维持中发挥比较重要的作用。本实验将IL-10基因导入乳酸杆菌并表达,并将其用于硫酸葡聚糖钠（dextran sodium sulphate, DSS）造模小鼠的治疗,观察其对小鼠肠道炎症的影响,对其作用机制进行了初步探讨。方法第一部分构建表达白介素10（IL-10）的重组乳酸杆菌人工合成信号肽系列与IL-10基因连接后克隆到干酪乳酸杆菌（lactobacillu casei, L. casei）整合型表达载体pIlac的lac启动子下游,得到重组质粒pIlac-sp-IL10,电穿孔转化L. casei CECT 5276。挑选转化后的耐药菌落在含红霉素培养基中培养,抽提染色体DNA, PCR及测序鉴定证实IL-10基因是否整合到干酪乳酸杆菌的基因组中,Western blot检测重组蛋白表达。第二部分转IL-10乳酸杆菌联合5-氨基水杨酸对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的影响及机制的初步探讨将实验小鼠分为七组,正常对照组,DSS造模组,DSS造模+5-ASA治疗组,DSS造模+乳酸杆菌组（菌液2×108CFU/ml）+5-ASA治疗组；DSS造模+低剂量转IL-10乳酸杆菌组（菌液2×107CFU/ml）+5-ASA治疗组；DSS造模+中剂量转IL-10乳酸杆菌组（菌液2×108CFU/ml）+5-ASA治疗组；DSS造模+高剂量转IL-10乳酸杆菌组（菌液2×109 CFU/ml）+5-ASA治疗组。于试验第十一天将小鼠处死,观察指标包括小鼠一般情况,结肠长度,结肠组织病理学评分（histopathological score, HS）,疾病活动指数（disease activity index, DAI）等,并分别对小鼠外周血行pCR检测NF-κB、PPAR-γ、IFN-γ、TGF-β、IL-10,结肠粘膜组织行western blotting检测PPAR-γ/IFN-γ、TGF-β、IL-10水平。结果第一部分成功将IL-10基因整合到干酪乳酸杆菌的基因组中；转基因乳酸杆菌产生的目的蛋白部分分泌进入培养上清。第二部分1浓度2×108CFU/ml的转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的改善优于2×108CFU/ml的乳酸杆菌（P<0.05）；2三种浓度（2*107CFU/ml,2*108CFU/ml,2*109CFU/ml）的转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症改善效果不一：浓度越高,效果越明显。结论转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症缓解有一定效果,效果和浓度有关。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 构建表达IL-10的重组乳酸杆菌
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 转IL-10乳酸杆菌联合5-氨基水杨酸对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的影响及机制的初步探讨
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 小结和讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录1 发表文章
• 附录2 插图索引
• 附录3 表格索引
• 致谢