烟草蚀纹病毒CP、HC-Pro基因克隆及与甘蔗花叶病毒之间交互保护作用的研究

论文摘要

烟草蚀纹病毒病是造成烟草生产损失的主要病害类群之一,近几年来在国内有扩大蔓延的趋势。本文在克隆烟草蚀纹病毒CP、HC-Pro基因的基础上,通过温室和田间试验研究了烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）与甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus, SCMV）之间的交互保护作用,从生物学的角度及分子水平上证实了TEV与SCMV之间存在交互保护作用的现象,这不仅为植物病毒马铃薯Y属（Potyvirus）不同病毒间交互保护作用的研究奠定了基础,而且也开拓了植物病毒病防治的新思路,实验结果如下:1.克隆了陕西分离物TEV CP基因和HC-Pro（登录号为DQ365889）基因,其中TEV HC-Pro是国内首次报道;与美国TEV CP、HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为97.34%、96.66%,氨基酸的同源率分别为99.2%、99.78%。2.将TEV CP基因定向插入EcoRI/Sac I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-TEVCP;经IPTG诱导后成功表达了分子量约为37ku的蛋白。以此蛋白为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,用琼脂双扩散法测其效价为1/128。3.为了获得高活性的表达蛋白,将TEV CP基因插入EcoRI/Not I切开的pPIC9K,构建了真核表达载体pPIC9K-TEVCP;经甲醇诱导后成功表达了分泌性蛋白,大小约为37ku。并与原核表达的蛋白制备的抗血清有很好的血清学反应,可作为抗原制备高特异性的抗血清以提高TEV病毒的检测灵敏度。4.在温室,对SCMV与TEV交互保护作用设计了三种处理方式,处理Ⅰ（混合接种10%SCMV+1-2%TEV）和处理Ⅱ（先用10%SCMV保护接种,7d后挑战接种1-2%TEV）的烟草在初期均有少量疱疹结构,后期有轻微蚀刻的症状;处理Ⅲ（保护接种和挑战接种的时间间隔为0.5、1、3、5、7、9、11、15和20d）的烟草在初期均未表现症状,后期出现轻微花叶的症状;对照CK1（只保护接种SCMV）的烟草无症状,对照CK2（只挑战接种TEV）的烟草在前期呈现斑驳花叶的症状,后期叶片为典型蚀纹症状;对照CK3（缓冲液接种）的烟草无症状。处理Ⅰ、Ⅱ中SCMV对TEV保护效果分别为61.0%、54.4%;在处理Ⅲ中,当两次接种时间间隔为0.5d时,SCMV对TEV的保护效果为60.0%,间隔1、3、5、7和9d时,保护效果均为66.6%,间隔11、15和20d时保护效果均为60.0%。在大田,对SCMV与TEV交互保护作用设计了两种处理方式,处理A(烟田四周（种植2行玉米）和处理B（每5行烟种植1行玉米）的烟草叶片平展、光滑,无蚀

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 烟草病毒病的概况
• 1.2 交互保护作用的国内外研究历史及现状
• 1.3 烟草蚀纹病毒的分子生物学研究进展
• 1.4 玉米矮花叶病毒研究进展
• 1.5 植物病毒的定量检测
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 烟草蚀纹病毒CP、HC-PRO 基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.2 所需仪器和试剂耗材
• 2.3 陕西分离物TEV CP 基因的克隆、序列分析及差异
• 2.4 陕西分离物TEV HC-PRO基因的克隆及序列分析
• 2.5 结果与分析
• 2.6 讨论
• 第三章 TEV CP 基因的表达
• 3.1 材料
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 第四章 SCMV 与TEV 之间的交互保护作用
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介