异丙酚对人血管内皮细胞缺氧复氧损伤的影响与机制探讨

论文摘要

异丙酚对人血管内皮细胞缺氧复氧损伤的影响与机制探讨前言近二十年来，防治缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）成为组织和器官保护研究的主要方向。Murry等于1986年首先发现反复多次的短暂缺血可以对随后发生的致死性IRI产生显著保护作用，并提出缺血预适应（ischemic precondition，IPC）的概念。随着有关预适应研究的不断进展，发现药物预适应可产生类似于IPC的保护作用，激活G蛋白耦联受体、ATP敏感性钾通道以及抑制氧自由基产生等实现，而且安全、易控受到广泛重视。迄今为止有关麻醉药预适应的研究多集中在吸入麻醉药对神经细胞和心肌细胞的作用，而静脉麻醉药作为围术期重要的临床用药，关于其对IRI的报道较少，是否有保护作用存在争议，确切机理仍不清楚。在缺血性脑卒中、心肌梗塞等许多严重疾病及危重症发生循环障碍时，首先导致血管内皮细胞（vascular endothehM cell，VEC）死亡和功能紊乱，目前认为IRI早期VEC结构和功能改变是IRI发生、发展的病理生理基础，可进一步加重组织损伤和破坏。缺氧复氧损伤可模拟机体IRI，有关异丙酚（propofol，PF）对缺氧复氧损伤VEC的作用未见报道，因此本研究拟观察临床相关浓度的PF预处理对缺氧复氧损伤人VEC凋亡的影响以及细胞内调节因子如核因子κB（NF-κB）、诱生型氮氧合酶（iNOS）、蛋白激酶C（PKC）等的表达变化，探讨其对IRI的作用及相关细胞调节机制，为围术期组织器官功能保护提供新的理论依据。实验材料1、实验试剂异丙酚（阿斯利康，英国）；Bcl-2兔抗人多克隆抗体（即用型）（Santa，美国）；caspase-3、PKC-Epsilon兔抗人多克隆抗体（Neomarker，美国）；HistostainTM plus kits SP 9000免疫组织化学试剂盒、DAB染色试剂盒、生物素标记羊抗兔IgG（北京中杉生物公司）；胰蛋白酶（1∶250）（Amresco，美国）；DMEM培养基（Gibco，美国）；极品胎牛血清（天津灏洋生物）；FITC-Annexin V（宝灵曼，德国）；Furo-2、碘化丙啶（Sigma，美国）；Trizol（Invitrogen，美国）；One step RT-PCR试剂盒（Promega，美国）；PVDF蛋白印迹膜（Bio-Rad，美国）；VEGF（血管内皮细胞生长因子，本校实验病理研究室自制）；其余化学试剂均为国产分析纯2、实验仪器振荡水浴箱（GFL THERMOLAB，美国）超低温冰箱（SANYO MDF-U，日本）旋涡振荡器（VORTEX-2 GENE，美国）水平板电泳系统（BIO-RAD Sub-cell GT，美国）通用电泳仪（BIO-RAD PowerPac200，美国）台式低温高速冷冻离心机（Sigma 3K30，美国）二氧化碳细胞培养箱（KENDRO／HERAEUS，德国）细胞培养专用超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）倒置显微镜（OLYMPUS AX70，日本）水平摇床（GFL，美国）显微图像分析系统（Qlympus AX70／Coolsnapfx／MetaMorph，日本）电热恒温鼓风干燥箱（余姚TDW，中国）自动电泳凝胶成像分析仪（Alphainnotech ChemiImager 5500，美国）小型垂直电泳仪（Bio-Rad Mini-Protein，美国）半干转印仪（Bio-Rad Seimidry transfer system，美国）FACS Calibur流式细胞仪（BD，美国）自动封膜仪（江苏仪器设备公司，中国）HEIDOLPH DIAX900型匀浆机（德国）PTC-100型PCR扩增仪（USA）GLS-700D型数码凝胶扫描分析系统（上海，中国）A-200 Ds电子天平（美国）B-Brown微量泵（德国）超纯水装置（MILLIPORE MILLI-Q，美国）实验室制冰机（ZIGERA 2BE-70-35，德国）恒温振荡培养箱（GFL，德国）小型台式离心机（SIGMA 1-13，美国）PH计（WTW InoLab，德国）电动高压消毒锅（HIRAYAMA HVE-50，美国）HSS-1数字超级恒温浴槽（成都仪器厂，中国）倒置相差显微镜（OLYMPUS，日本）培养皿、培养板、培养瓶、离心管等（Corning，美国）实验方法1、人脐静脉内皮细胞的继代培养0.125％胰蛋白酶消化法分离内皮细胞，用含20％胎牛血清、100μg／ml VEGF、50U／ml肝素的DMEM培养基接种于培养皿或培养瓶中，于37℃、5％CO2、95％空气的培养箱中静置培养，待细胞生长至融合单层时，以细胞数为1×105／ml传代培养，选取第3～4代细胞进行实验。培养细胞采用免疫荧光化学方法检测人Ⅷ因子相关抗原呈阳性，鉴定为人血管内皮细胞。2、缺氧复氧模型的建立细胞培养至融合状态，用99.9％高纯氮气饱和15min的低糖DMEM培养液换液，然后将细胞置于密闭良好的缺氧复氧特殊装置中，充入高纯氮气置换装置内空气造成缺氧。气体通过滤过装置流速为5L／min，5min后关闭进出气阀门，放入5％CO2培养箱37℃培养30min。复氧时迅速打开装置，用含20％胎牛血清的含糖DMEM营养液换液后置于培养箱中正常培养，实现VEC缺氧复氧损伤，各组按设计分别于复氧2h、6h、24h和48h后将一部分爬片细胞以冷丙酮固定备用，另一部分细胞消化离心后，液氮冷冻，-70℃保存备用。3、实验分组细胞培养至融合状态，随机分为3组。正常对照组（C组）、缺氧复氧组（HR组）和缺氧复氧+异丙酚组（PR组），HR组依复氧时间不同（2、6、24、48h）又分为4个亚组（HR2、HR6、HR24、HR48组），PR组按PF浓度不同（25、50、100μmol／L）分为12个亚组。PR组于缺氧前30min加入含不同浓度PF（25、50、100μmol／L）的培养液，于37℃、5％CO2培养箱内孵育30min，再进行缺氧复氧处理。4、检测指标（1）流式细胞仪FITC-Annexin V／PI双标法检测细胞凋亡（2）免疫细胞化学染色检测Bcl-2、caspase-3蛋白表达（3）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测iNOS及NF-kappaB mRNA表达（4）免疫蛋白印迹杂交（Western-blot）检测PKC蛋白表达（5） Fura-2／AM荧光标记测定细胞内钙离子浓度5、图像分析免疫细胞化学染色图片，在光学显微镜Olympus AX70下观察，从每组中选取8-10张切片，每张切片随机选取5～7个视野，通过MetaMorph4.5图像分析软件自动测定每个视野阳性细胞的光密度（Optical density，OD），并计算其平均值。Western Blot和RT-PCR测定电泳条带密度值，在自动电泳凝胶成像分析仪上分析结果。流式细胞仪检测采用CellQUEST分析软件分析结果。6、统计学处理实验数据采用均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett T3检验，P＜0.05差异具有显著性。结果1、PF对缺氧复氧损伤VEC凋亡的影响随着缺氧复氧时间延长，细胞损伤加重，凋亡数量增多，至24h达高峰。不同浓度异丙酚预适应明显减轻缺氧复氧引起的细胞损伤，降低细胞凋亡；50、100μmol／L PR组形态改变更小，凋亡细胞明显减少，与相应的HR组比较有显著性差异（P＜0.01）。2、PF对缺氧复氧损伤VEC Bcl-2蛋白表达的影响C组细胞Bcl-2蛋白表达较低，缺氧复氧处理后，Bcl-2表达明显下调，复氧24h达低谷，48h部分恢复。PF对缺氧复氧损伤VEC Bcl-2蛋白表达的影响呈剂量依赖关系，25μmol／L PR组Bcl-2蛋白表达与相应的HR组比较有显著差异（P＜0.01）；50、100μmol／L PR组与相应HR组比较差异显著（P＜0.01），且与25μmol／L PR组比较有显著差异（P＜0.05）。3、PF对缺氧复氧损伤VEC caspase-3蛋白表达的影响正常培养的VEC caspase-3蛋白表达较低，复氧2h后caspase-3表达轻度增强，6h达较高水平，24h处于高峰，48h有所下降。PF对缺氧复氧损伤VEC caspase-3蛋白表达的影响呈剂量依赖关系，25μmol／L PR组caspase-3蛋白表达与相应的HR组比较有显著差异（P＜0.01）；50、100μmol／L PR组与相应的HR组比较差异显著（P＜0.01），且与25μmol／L PR组比较有显著差异（P＜0.05）。4、PF对缺氧复氧损伤人VEC细胞内钙稳态的影响缺氧复氧损伤可引起细胞内钙浓度明显升高，PF（25、50、100μmol／L）可显著降低细胞内钙超载，各亚组与相应的HR组比较差异显著（P＜0.01）。5、PF对缺氧复氧损伤人VEC内PKC表达的影响缺氧复氧使细胞内PKC蛋白表达降低（P＜0.01）；PF活化PKC蛋白表达，显著抑制由缺氧复氧引起的PKC表达下调，与HR组比较差异显著（P＜0.01）。6、PF对缺氧复氧损伤人VEC的iNOSmRNA表达的影响C组iNOS表达较低，缺氧复氧使iNOSmRNA表达明显升高；PF抑制iNOS mRNA活化，显著降低其表达，但未达正常水平。7、PF对缺氧复氧损伤人VEC的NF-kappaB表达的影响缺氧复氧激活NF-kappaB使其mRNA含量明显升高；PF预处理抑制NF-kappaB表达，与相应HR组比较差异显著（P＜0.01）。讨论在心肺复苏、器官移植、溶栓术、冠脉搭桥术等临床实践以及抢救存在血流灌注不足的危重病人时，防治器官IRI是医生面临的严峻问题。Murry等首先发现IPC现象，能显著减少心肌损伤，提高心脏耐受性，降低梗死范围，产生心肌保护作用，是有效防治IRI的方法之一。近年来，预适应成为组织及器官保护研究热点课题，药物预适应因其更易于应用而越来越受到关注，麻醉药预适应（Anesthetic precondition，APC）是药物预适应的重要组成部分。目前有关吸入麻醉药的研究较多，认为如异氟醚、七氟醚等对缺氧和IRI有保护作用，机理主要涉及ATP敏感性钾通道、自由基、腺苷等；而关于静脉麻醉药的报道不一致，认为硫贲妥钠、咪唑安定元保护作用，氯胺酮可逆转其它药物的保护作用，异丙酚虽具有抗氧化作用，但在IRI中作用争议颇多，确切机制尚不清楚。VEC分布广泛，是血液和组织间的第一道屏障。不仅如此VEC在IRI中具有十分重要的地位，其结构和功能异常早于实质细胞出现，恢复也早于实质细胞，其受刺激可产生多种细胞因子，作用于粒细胞等炎性细胞，预后影响组织损伤的进展。PF作为一种具有抗氧化作用的新型静脉麻醉药，广泛应用于临床麻醉及ICU镇静，关于其对缺氧复氧损伤人VEC的作用尚未见报道。因此本研究采用体外培养的人脐静脉内皮细胞建立缺氧复氧损伤模型，观察临床相关浓度的PF预处理对缺氧复氧损伤VEC的影响，并探讨其可能的作用机制。结果显示PF以剂量依赖方式削弱缺氧复氧引起的VEC凋亡，调节凋亡相关因子caspase-3、Bcl-2的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制caspase-3活化。同时发现PF能有效地降低缺氧30min复氧6h时VEC中钙离子浓度的升高，同时上调蛋白激酶C的表达，提示PF可激活PKC途径，减轻缺氧复氧引起的细胞内钙超载，达到保护细胞目的。这与应用PKC激活剂能产生类似于IPC对心肌的保护作用，而PKC抑制剂则阻断这一效果的结论相一致，表明PKC、Ca2+是IRI和预适应中的重要环节，是维持细胞功能的有效调节因子。应用RT-PCR方法观察核因子NF-κB及诱生型氮氧合酶（iNOS）mRNA表达的变化，结果显示异丙酚能明显降低复氧6h时二者的表达。由于iNOS能诱导细胞产生大量的NO，对NO介导的细胞损伤起关键作用，提示抑制NF-κB活化，降低iNOS的表达，在PF防止细胞凋亡中占有重要地位。本研究选取人VEC的缺氧复氧模型能更好地模拟人体IRI状态并避免在体实验中其它混杂因素干扰；采用临床相关浓度的PF可以为临床应用提供有力的参考依据；对于NF-κB、iNOS及PKC、细胞内钙浓度调节与缺氧复氧引起凋亡的观察结果从细胞分子水平探讨了PF预处理的机制，为PF用于防治IRI奠定了理论基础。但临床上应用PF是否能发挥器官保护作用尚待实践，有关的细胞内触发和调节途径仍需进一步研究。结论1、缺氧复氧损伤使促凋亡因子caspase-3表达升高，凋亡抑制因子Bcl-2表达降低，导致VEC凋亡，二者变化与缺氧复氧损伤存在一定时相关系。2、PF预处理以剂量依赖方式抑制缺氧复氧引起的VEC凋亡，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低casepase-3表达是效应因子。3、PF能降低缺氧复氧损伤所致的细胞内钙离子浓度升高，蛋白激酶C参与其抑制细胞内钙超载，是PF发挥保护作用的细胞内信号转导调节因子。4、抑制缺氧复氧损伤导致的NF-kappaB活化，减少iNOS的生成在PF预处理的保护作用中占重要地位。

论文目录

• 一、摘要
• 1. 中文论著摘要
• 2. 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、前言
• 四、论文
• 论文一 异丙酚对缺氧复氧损伤人血管内皮细胞caspase-3和Bcl-2表达的影响
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 论文二 PKC、细胞内钙稳态: 异丙酚预适应的细胞内作用靶位
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果（附论文图片）
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 论文三 异丙酚预适应的细胞调节机制:NF-kappaB及iNOS的表达
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 3. 结果（附论文图片）
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 五、本研究创新性的自我评价
• 六、参考文献
• 七、附录
• 1. 综述
• 2. 在学期间科研成绩
• 3. 致谢
• 4. 个人简介