论文摘要
超抗原是一种具有强大免疫刺激功能的新型蛋白质抗原,业已证明超抗原参与多种疾病的发病过程。金黄色葡萄球菌（金葡菌）肠毒素超抗原家族涉及的疾病谱非常广泛,并且也是一种失能型的生物战剂,一直是比较活跃的研究领域。已取得的研究进展提示我们,目前针对金葡菌肠毒素超抗原所致疾病除了临床对症支持治疗外,尚无很好的针对超抗原的治疗手段,因此,从其超抗原特性入手,寻找有效控制肠毒素毒性作用的方法,可以进一步为相关疾病的防治研究和生物武器防护提供新的手段。SEA、SEB、SEC和SED是常见的毒性作用较强的金葡菌肠毒素,国内外对其研究内容大多数是利用其超抗原免疫活性进行抗肿瘤临床治疗等,针对超抗原的活性本身来研究超抗原相关疾病的防治手段较少。目前的研究主要是针对肠毒素的免疫识别区域设计小分子多肽和构建并筛选肠毒素的减毒突变体,从这两方面研究抑制肠毒素超抗原的活性的手段。但是大多数研究都是对单一种类的肠毒素研究,针对多种肠毒素的广谱抑制性手段的研究很少。基于上述问题,我们针对葡萄球菌肠毒素同源序列设计了9条小分子多肽,通过细胞模型筛选具有广谱抑制性的多肽分子,并运用动物模型检测筛选到的抑制性多肽对动物的保护作用,研究抑制性肽与MHCⅡ类分子的亲和力,预测抑制性肽的空间结构,探讨其广谱抑制活性的机制;同时构建了SED减毒突变体,并检测了该突变体的促人PBMC增殖活性、MHCⅡ类分子结合活性和TCRVβ特异性。主要研究内容和结果包括以下几方面:1.抑制性多肽的设计和合成,对金葡菌肠毒素家族的序列进行比较,选择具有同源性的保守序列设计多肽,共设计了9条多肽。2.建立人外周血单个核细胞的细胞模型,检测9条合成多肽对超抗原的抑制效应。主要从多肽对SEs刺激人PBMC的增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β的抑制效应进行检测,筛选具有广谱抑制性效应的多肽,试验结果显示多肽P72对SEA、SEB和SEC超抗原活性具有明显抑制作用,其他8条多肽对SEs的抑制作用不明显。确证试验显示P72对PHA、ConA的促PBMC增殖活性无抑制作用。3.建立8周龄雌性BALB/c小鼠感染性休克的动物模型,以脂多糖（LPS）和D-氨基半乳糖（D-GalN）致敏小鼠,再用不同剂量的SE进行攻击,获得了此条件下SEA、SEB和SEC的最低致死剂量。利用该动物模型检测多肽P72对SEA、SEB和SEC攻击小鼠的保护效果,结果显示P72对SEA、SEB和SEC致休克效应具有显著的保护作用。4.竞争结合实验检测抑制性多肽P72与MHCⅡ类分子的结合活性,结果显示多肽P72不能与SEA、SEB和SEC有效竞争结合Raji细胞上的MHCⅡ类分子,提示P72可能不是通过与MHCⅡ类分子结合产生的抑制活性。5.对抑制性多肽P72的空间结构进行预测,将P72在SEA、SEB、SEC的同源序列的空间结构进行对比,结果显示3种超抗原与P72同源的序列在空间结构上具有高度的相似性。6.构建了SEDN23A/H26R突变体。并对突变体蛋白进行纯化、定量和免疫印迹分析。检测了SEDN23A/H26R突变体促T淋巴细胞增殖的活性,结果显示其促增殖活性比SED显著降低;以竞争实验检测SEDN23A/H26R突变体与MHCⅡ类分子的结合活性,并用流式细胞仪检测突变体TCRVβ特异性变化。结果:突变体SEDN23A/H26R与MHCⅡ类分子的亲合力未发生变化,但刺激人TCRVβ5+T细胞水平显著降低。综上,本研究设计并筛选到了1条广谱抑制性多肽P72,P72能够在体外和体内显著抑制SEA、SEB、SEC的超抗原活性,证实了P72可能不是通过与MHCⅡ类分子结合对SEs产生的抑制作用;发现N23、H26位氨基酸残基可能是SED与人TCRVβ5结合的关键位点;研究结果丰富了对SEs超抗原免疫识别机制的认识,为细菌性超抗原相关疾病的防治以及生物武器防护技术的研究提供了新的手段。