水稻新型Ac/Ds标签突变体库的构建与分析

论文摘要

随着水稻精确图位序列的完成释放,水稻功能基因组学研究成为今后研究的热点和重要课题,建立突变体库是研究植物功能基因组一条重要而有效的途径。本研究利用含Ac和Ds元件的亲本系组配杂交组合,建立了大规模的插入突变群体,由于在Ds载体的特定位置插入了BAR基因,可以在秧田里直接从杂交后代中高效的选择转座系,大大节省了时间和劳动量的投入;系统的分析了F1代和F2代的转座频率和转座行为,并对产生的突变体进行了初步的研究。主要结果如下: 1.利用新型的Ac/Ds标签系统构建了水稻大规模插入突变群体,验证了新型Ds载体中BAR基因在田间大规模选择转座系的可靠性,可行性及有效性,结果发现Basta田间选择与实验室鉴定结果高度符合,表明该系统适合于水稻大规模插入突变体库的构建。 2.为了构建插入突变群体,我们用4个Ds亲本系与20个Ac亲本系组配了66个不同杂交组合,F1植株发生了高频率的体细胞转座,但未检出性细胞转座;F2代共有636个株系及137,437个单株,其中36,160个为转座植株。分析了F2群体的转座频率,发现来源于Ds1、Ds3和Ds4亲本系的F2代发生性细胞转座的频率较高,分别为46.9%、37.6%、36.9%;来自同一杂交组合的不同F2姐妹系的转座频率有很大的差异,这种差异可能源自转座时间的不同;3个亲本系的F2代的性细胞转座频率主要集中在30%-50%范围内。 3.4个Ds亲本系中,Ds2亲本系的F2代发生性细胞转座的频率很低,源于265个株系的48,746个F2植株中,仅有6个株系的203个植株发生转座,可能发生了转座失活,转座失活的原因不是由Ac转座酶失活所致,可能是在Ds2亲本系中发生转座元件的失活。 4.分析了不同杂交组合方式（Ds/Ac和Ac/Ds）及Ac元件的拷贝数对F2代性细胞转座频率的影响,发现正反交对性细胞转座频率没有影响;单拷贝的Ac元件与两个拷贝的Ac元件的性细胞转座频率差异不显著。 5.分析了F2植株旁测序列标签（FSTs）位点,发现52个FSTs分布于水稻的10条染色体上,2个FSTs分布在原始T-DNA供体位点附近,其余50个FSTs分布在原始T-DNA供体位点较远位置,表明Ds元件可以在全基因组范围内转座。FSTs在水稻的10条染色体上分布不均,第4和第11染色体上插入的密度较大,占全部FSTs的54%。所分析的52个FSTs中,67.3%的FSTs位于预测的基因中。来源于相同F2株系的姐妹植株FSTs定位于水稻基因组中不同的位置上,表明F2株系姐妹植株可以发生独立的转座事件。 6.分析了GUS在F3标签系不同器官中的表达活性,发现GUS在根、叶、幼穗及花中都具有表达活性,但对于不同的标签系,在不同器官中的表达活性有所差异,在植株发育的不同时期GUS表达活性也有所差异,表明了基因捕获器在转座标签系中的捕获作用。 7.利用Ac/Ds标签系统在F2及F3代产生了一些可见表型的突变体,记录了这些突变体的表型性状和农艺性状;对矮杆卷叶突变体cul15（t）的遗传分析初步表明:cul15（t）突变体为Ds插入造成的、受一对隐性基因控制的突变体,该突变体对GA3敏感。 8.利用反向遗传学方法对标签系OsPI-PLC2进行了分析,验证了Ds标签在OsPI-PLC2基因中插入位点:RT-PCR结果表明OsPI-PLC2基因是诱导型的表达方式,可以在不同的环境胁迫和渗透胁迫的诱导下表达,同源分析表明OsPI-PLC2蛋白质与拟南芥AtPI-PLC蛋白质具有较高的同源性,但与水稻的OsPI-PLC1的同源性较低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 水稻基因组学研究
• 1.1.1 水稻结构基因组学研究
• 1.1.1.1 水稻高密度遗传图谱和物理图谱
• 1.1.1.2 水稻基因组测序进展
• 1.1.2 水稻功能基因组学研究
• 1.1.2.1 水稻功能基因组学研究内容
• 1.1.2.2 水稻功能基因组学研究策略
• 1.2 研究植物功能基因组的几种突变体库
• 1.2.1 构建突变体库的意义
• 1.2.2 突变体库的种类及各自的特点
• 1.2.2.1 自发突变体库及其特点
• 1.2.2.2 理化诱变突变体库及其特点
• 1.2.2.3 插入突变体库及其特点
• 1.3 Ac／Ds标签系统研究进展
• 1.3.1 植物转座子概况
• 1.3.1.1 DNA介导的转座元件类型、结构及特点
• 1.3.1.2 逆转座子类型、结构及特点及生物学意义
• 1.3.2 Ac／Ds结构及利用该系统克隆的基因
• 1.3.3 Ac／Ds标签系统的转座行为及其插入突变群体
• 1.3.3.1 Ac/Ds标签转化载体的改良和完善
• 1.3.3.2 Ac/Ds系统的转座行为
• 1.3.3.3 转座元件活性的恢复
• 1.3.3.4 转座距离和转座热点问题
• 1.3.3.5 插入突变体库容量及插入突变体的表型问题
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 水稻大规模Ds插入突变体库的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 植物材料
• 2.2.1.2 本试验所用转化载体
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 Ac和Ds转基因株系的拷贝数的Southern杂交分析
• 2.2.2.2 水稻基因组DNA的微量提取
• 2.2.2.3 PCR检测
• 2.2.2.4 Basta检测
• 2.2.2.5 旁测序列分析
• 2.2.2.6 GUS表达分析
• 2.2.2.7 全基因组甲基化分析
• 2.2.2.8 序列分析软件或工具
• 2.3 结果
• 2.3.1 组配杂交组合的Ac和Ds转基因亲本系的拷贝数
• 2.3.2 F1代植株Ds元件的转座行为
• 2.3.3 F2代Ds插入标签群体的产生及Ds元件转座行为
• 2.3.3.1 F2植株田间Basta选择及PCR鉴定
• 2.3.3.2 F2插入标签群体及其转座频率
• 2.3.4 不同的杂交组合方式及Ac亲本系的拷贝数对Ds转座频率的影响
• 2.3.5 Ds旁测序列标签的定位与分析
• 2.3.6 GUS在插入标签系中的表达模式
• 2.4 讨论
• 2.4.1 实用的、高效的大规模构建水稻插入突变体库的Ac/Ds标签系统
• 2.4.2 转座元件的失活
• 2.4.3 转座发生的时间及插入位点在水稻基因组中的分布
• 第三章 Ac／Ds标签系统产生的突变体及分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 突变体的形态观察
• 3.2.2.2 水稻基因DAN的提取
• 3.2.2.3 突变体与野生型Ac及Ds元件的PCR检测
• 3.2.2.4 OsPI-PLC2标签系旁测序列的PCR验证
• 3.2.2.5 植物材料的诱导处理
• 3.2.2.6 GA3处理
• 3.2.2.7 植株总RNA的提取
• 3.2.2.8 反转录PCR反应（RT-PCR）
• 3.2.2.9 序列分析软件或工具
• 3.3 结果
• 3.3.1 Ac／Ds标签系统所产生的突变体
• 3.3.2 F2代突变体的表型及农艺性状调查
• 3.3.3 一个矮杆卷叶突变体的遗传及生理的初步分析
• 3.3.3.1 矮杆卷叶突变体的发现及表型
• 3.3.3.2 矮杆卷叶突变体初步遗传分析
• 3.3.3.3 矮杆卷叶突变体对外源激素GA3的反应
• 3.3.4 一个表型无明显变化插入标签系OsPI-PLC2的反向遗传学分析
• 3.3.4.1 标签系OsPI-PLC2旁测序列及插入位点
• 3.3.4.2 标签系OsPI-PLC2插入位点的验证
• 3.3.4.3 OsPI-PLC2基因所编码蛋白质及同源性比较
• 3.3.4.4 OsPI-PLC2基因的表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 Ac／Ds标签系统产生可见突变体频率问题
• 3.4.2 反向遗传学在Ac／Ds标签系统中的应用
• 3.4.3 Ds标签突变体的鉴定
• 3.4.4 OsPI-PLC2插入突变体及水稻PI-PLC基因功能
• 第四章 进一步研究计划
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录 主要试剂配方
• 致谢
• 作者简历