鲢鱼卵CPIs的纯化鉴定及其抑制鱼糜凝胶软化的研究

论文摘要

本研究通过综合运用各种层析方法,从鲢鱼卵中分离纯化了两种小分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子（CPIs）,并鉴定了其理化和生物学性质,为进一步深入研究鲢色CPIs奠定基础。同时探讨了两种小分子CPIs在抑制鲢鱼鱼糜凝胶软化中的作用,以期开发为鱼糜凝胶弹性增强剂,为合理高效利用鲢鱼下脚料提供了理论依据。首先明确了papain水解azocasein底物的酶反应初速度条件（azocasein 2.5mg, papain 6.25μg,反应30min或papain用量18.75μg,反应10mmin）,并用E-64标定了papain（1.25mg/mL）的有效摩浓度为6.05μM。在此基础上,分别用azocasein法和荧光底物法对怀卵期（Ⅳ期）鲢鱼卵及皮匀浆液中的半胱氨酸蛋白酶抑制（CPI）对papain的抑制活性进行了比较,结果azocasein法证明Ⅳ期卵中CPI活性量（90.03unit/ml）高于皮（26.96 unit/ml）,而皮中CPI比活（14.19unit/mg）高于卵（3.98unit/mg）,而荧光底物法尽管具有较高的灵敏度,但是却检测不到卵均浆液中CPI抑制活性。对总活性量较高的鲢鱼卵CPIs进行了粗分离提取（匀浆、酸处理、盐析透析、超滤浓缩）。对各提取步骤同时采用azocasein法和荧光底物法进行监测,发现酸处理后的各步骤,用荧光底物法可以检测到鱼卵CPI抑制活性。选取鲢鱼卵的CPI超滤浓缩粗提液为材料进行层析纯化,层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物（Z- Phe-Arg-MCA）法监测CPI抑制活性。经Sp Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性峰。选择其中分离较好,抑制活性高,且紫外吸收值低的Ⅰ峰和Ⅲ峰部分进行深入纯化鉴定。Ⅰ峰经Sephacryl S-100分子筛层析、LH-20反相层析得到了纯化。最终结果表明卵中的CPI-Ⅰ纯化了25.25倍,收率为1.26%。CPI-Ⅰ在还原性SDS-PAGE呈现分子量为10.5KDa一条带,与利用Sephacryl S-100分子筛层析marker标准曲线,初步判断分子量为11KD的结果相符合。反相酶谱法证明该10.5KDa蛋白能够抑制papain对底物明胶的水解。PAS染色证明其为非糖蛋白。CPI-Ⅰ在pH3.0-pH7.0条件下稳定,残余抑制活性均在60%以上,且热稳定性试验表明,CPI在60℃以下稳定,残余抑制活性均在80%以上。利用Dixon-plot作图法测得CPI-Ⅰ属于竞争性抑制剂,抑制常数Ki为96.97 nM。Ⅲ峰经Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、Sephacryl S-200分子筛层析、ConA Sepharose4B亲和层析得到了部分纯化。最终结果表明卵中的CPI-III纯化了331.66倍,收率为0.78%。CPI-III在还原性SDS-PAGE上呈现两条小分子量的条带,以及利用Sephacryl S-200分子筛层析marker标准曲线分子量分别为16.5KDa和12KDa。反相酶谱鉴定证明其中16.5KDa的蛋白带是半胱氨酸蛋白酶抑制因子。PAS染色证明CPI-III为非糖基化蛋白。鱼糜凝胶软化的抑制研究表明,当纯化的CPI-I及部分纯化CPI-III在鲢鱼糜中的添加量同为3units/g （azocasein法）时,它们均明显抑制了鱼糜凝胶软化,相对于对照组,破断力分别增加了9.8%（p>0.05）和115.6%（0.01<p<0.05）,凝胶强度分别增加了28.96%（p<0.01）和32.36%（p<0.01）。试验组和对照组鲢鱼糜蛋白的SDS-PAGE检测表明,添加纯化的鲢鱼卵CPI-I及部分纯化CPI-III,可显著抑制半胱氨酸蛋白酶引起的肌球蛋白的降解,与对照组（%）相比,添加CPIs减小了肌球蛋白降解率（16.2%和17.93）。因此,可将鲢鱼卵CPI用于抑制其自身鱼糜的凝胶软化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述与立题依据
• 1.1 立题依据
• 1.2 半胱氨酸蛋白酶抑制因子概述
• 1.2.1 Cystatin超家族的分类
• 1.2.2 Cystatin超家族的分子结构特征
• 1.3 Cystatin的纯化鉴定研究进展
• 1.3.1 陆生动物来源Cystatin
• 1.3.2 鱼类来源的Cystatin的纯化鉴定研究进展
• 1.4 Cystatin在食品领域的应用
• 1.4.1 利用Cystatin抑制鱼糜凝胶软化
• 1.4.2 Cystatin作为影响肉质的候选因子
• 1.4.3 Cystatin在鱼卵及幼鱼发育中的作用及与肉质的潜在关系
• 1.5 Cystatin的生理作用
• 1.6 研究目的意义及主要研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试验试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 CPI抑制活性测定
• 2.2.2 鲢鱼卵、皮中CPIs活性的比较
• 2.2.3 蛋白浓度测定
• 2.2.4 鲢鱼卵CPIs的层析纯化
• 2.2.5 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的鉴定
• 2.2.6 鲢鱼卵CPI-Ⅰ热稳定性pH稳定性抑制常数
• 2.2.7 CPI-Ⅰ对鲢鱼cathepsinB及cathepsinL的抑制活性
• 2.2.8 纯化CPIs对鲢鱼鱼糜凝胶软化的抑制作用
• 3.结果与分析
• 3.1 papain水解Azocasein的酶反应线性范围确定
• 3.2 E-64滴定法确定papain有效浓度
• 3.3 荧光标品AMC的标准曲线
• 3.4 鲢鱼卵、皮中CPIs活性含量比较
• 3.5 鲢鱼卵中CPIs的粗分离提取
• 3.6 鲢鱼卵CPIs的层析纯化
• 3.6.1 Sp Sepharose Fast Flow阳离子交换层析
• 3.6.2 SephacrylS-100分子筛层析
• 3.6.3 LH-20反相层析
• 3.6.4 Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析
• 3.6.5 Sephacryl S-200分子筛层析
• 3.6.6 ConASepharose4B亲和层析
• 3.6.7 鲢鱼卵CPI-Ⅰ及CPI-Ⅲ的纯化表
• 3.7 Sephacryl S-100分子筛层析marker的标准曲线及分子量测定
• 3.8 Sephacryl S-200分子筛层析marker的标准曲线及分子量测定
• 3.9 鲢鱼卵CPIs的SDS-PAGE反相酶谱及糖蛋白染色分析
• 3.9.1 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的SDS-PAGE分析
• 3.9.2 鲢鱼卵CPI-Ⅰ的反相酶谱及糖蛋白染色分析
• 3.9.3 鲢鱼卵CPI-Ⅲ的SDS-PAGE分析
• 3.9.4 鲢鱼卵CPI-Ⅲ的反相酶谱及糖蛋白染色分析
• 3.10 鲢鱼卵CPI-Ⅰ热稳定性pH稳定性抑制常数
• 3.10.1 CPI-ⅠpH稳定性的测定
• 3.10.2 CPI-Ⅰ热稳定性的测定
• 3.10.3 CPI-Ⅰ抑制常数Ki
• 3.10.4 CPI-Ⅰ对鲢鱼cathepsinB及cathepsinL的抑制活性
• 3.11 纯化CPIs对鲢鱼鱼糜凝胶软化的抑制作用
• 3.11.1 凝胶破断力测定
• 3.11.2 凝胶强度测定
• 3.11.3 鱼糜凝胶蛋白质图谱
• 4.讨论
• 4.1 关于酶反应线性范围的确定以及E-64滴定确定酶有效浓度
• 4.2 关于azocasein法和荧光肽底物法在抑制活性测定中的使用
• 4.3 关于鲢鱼卵CPI-Ⅰ和CPI-Ⅲ的纯化及性质鉴定
• 4.4 关于鲢鱼卵CPIs抑制cathepsin B和cathepsin L活性和鱼糜凝胶软化
• 结论
• 参考文献
• 致谢