论文摘要
随着现代社会的发展,事故伤害、战争、地震、肿瘤手术等导致神经损伤的人数逐年增加。我国周围神经损伤病例每年新增60～90万例,需要通过神经移植来修复神经的病例约为30万～45万例,若治疗不当造成终身残疾,导致严重经济负担和社会负担。目前治疗周围神经损伤的“金标准”是自体神经移植,但其受到供区神经来源不足,继发的供区神经功能丧失,以及供区神经结构和尺寸上不匹配等限制。因此,研发能够有效代替自体神经的移植替代物是国内外研究的热点。组织工程的发展为修复周围神经缺损提供了新的方法。组织工程神经由支架材料、种子细胞及生长因子三个要素组成,还应具备组成成份和空间结构双重仿生。神经来源细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）不仅为细胞提供了支持结构和附着位点,而且本身包含许多生物信息,能够提供细胞所需的信号,对细胞的粘附、迁移、增殖、分化及基因的表达调控有重要作用和显著影响,对神经再生有明显的引导和促进作用。然而,目前商业化神经再生导管材料中,采用的是猪或牛的Ⅰ、Ⅲ型胶原。这些材料只利用了细胞外基质的一部分,如何更好地保留ECM的主要成分并更好的构建组织工程神经成为研究热点。目的：本课题研究如何更好地构建组织工程神经并评价修复效果,即制备具有组成成分和结构仿生的天然神经ECM组织工程神经支架,同时复合具有促神经生长、低免疫原性的种子细胞构建组织工程神经,评价其修复周围神经缺损效果。方法：1.采用低渗冻融、机械粉碎、差速离心法制备神经细胞外基质。对其形态特征,免疫荧光染色观察组成成分,接种雪旺细胞或背根神经节评价细胞外基质生物相容性；2.定向结晶技术制备取向性神经源性ECM支架；生物力学测试仪测试神经源性ECM支架力学特性；并通过测量轴突神经距离评价修复周围神经缺损短期效果；3.体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）和人脐带Wharton间充质干细胞向雪旺细胞分化,免疫荧光染色鉴定表型特征；Dead/live染色检测生物蛋白胶中BMSCs存活情况及ELISA检测神经营养因子；不同数量的BMSCs生物蛋白胶复合物对背根神经节轴突生长长度、雪旺细胞迁移距离和轴突面积指数进行定量评价；4.采用不同方法分别在化学去细胞异体神经（chemical extracted acellular nerve allograft, CEANA）内部和周围添加添加类雪旺细胞,通过肢体功能评估和组织学检测的方法评价不同添加方法及添加不同细胞促CEANA神经再生的效果。结果：1.神经细胞外基质为直径30～130 nm的纳米微丝。Ⅰ型胶原、层粘蛋白、纤连蛋白染色阳性；大鼠背根神经节、雪旺细胞在神经细胞外基质上生长良好。2.神经源性ECM取向支架横截面呈多孔蜂窝状结构,纵截面孔道呈平行排列的管道结构；ECM取向支架、CEANA破裂强度、极限应力、极限应变及断裂功耗同正常神经相比,差异均有统计学意义（P<0.05）, CEANA同正常神经相比弹性模量无差异,而ECM取向支架弹性模量小于CEANA弹性模量（P<0.05）,。ECM取向支架修复周围神经缺损轴突生长长度小于CEANA （P<0.05）;3.向雪旺细胞方向诱导的大鼠BMSCs、ADSCs和人脐带Wharton间充质干细胞形态与雪旺细胞相似；免疫荧光染色p75和GFAP阳性。BMSCs生物蛋白胶复合物同大鼠背根神经节（Dorsal root ganglion, DRG）共培养组,轴突生长长度、雪旺细胞迁移距离和轴突面积指数明显大于空白对照组（P<0.05）。4. CEANA复合dADSC、dMSC和SCs均可提高小腿三头肌收缩力和小腿三头肌湿重恢复率。CEANA复合dADSC、dMSC和SC可使坐骨神经有髓纤维数增多和髓鞘厚度增加。CEANA内、外添加MSCs生物蛋白胶复合物对周围神经损伤修复,在功能评价和组织学评价具有类似的结果；结论：1.制备的神经源性ECM保留了天然神经基质源性成分,具有良好的细胞相容性：2.利用定向结晶技术制备出神经源性ECM取向性支架；神经源性ECM取向性支架力学特性有待进一步提高,而去细胞异体神经生物力学抗拉强度可满足神经移植材料力学特性要求；体内实验证实神经源性ECM取向性具有良好的生物相容性,但周围神经损伤短期修复效果低于CEANA;体外培养证实去细胞异体神经具有组成成份、管孔结构和管壁纤维取向排列的多重仿生,是理想的组织工程神经支架；3.大鼠BMSCs、ADSCs和人脐带Wharton间充质干细胞可诱导分化成类雪旺细胞,其形态和表型特征与雪旺细胞相似；BMSCs在生物蛋白胶存活并有效分泌与神经再生有关的生长因子,生物蛋白胶可做为组织工程神经细胞载体材料；不同数量BMSCs生物蛋白胶复合物对DRG生长的影响具有量效关系；4. CEANA复合BMSCsS和ADSCs源性类雪旺细胞,可提高周围神经损伤修复效果,与雪旺细胞移植修复神经缺损效果类似；CEANA周围添加BMSCs,具有同添加到去细胞神经内部相似的修复效果,不受添加种子细胞数量的限制和不破坏神经支架内部结构,是一种比较理想的方式。